Scientific journal

Modern high technologies

ISSN 1812-7320

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 0,940

Биовыщелачивание является одной из передовых технологий переработки золотосодержащих руд, к преимуществам которой можно отнести малоотходность и экологическую чистоту, поскольку газ и пыль в атмосферу не выделяются [1]. Технология биовыщелачивания проста в применении и высокоэффективна, особенно для переработки руд с низким содержанием драгоценных металлов. Она позволяет экономить материалы и энергию и в будущем может заменить такие способы переработки минерального сырья, как обжиг, автоклавное выщелачивание, металлургическая плавка, которые загрязняют окружающую среду ядовитыми газами и токсичными химикатами. В практике биовыщелачивания используют различные микроорганизмы в зависимости от поставленных целей. Наибольшей популярностью пользуются ацидофильные тионовые бактерии из рода Acidithiobacillus ferrooxidans.

Материалы и методы исследования

Изучение количественного и качественного состава микрофлоры месторождения Бакырчик проводили по общепринятым методикам. Пробы рудных вод при обследованиях отбирались стерильно, в соответствии с имеющимися руководствами. Подсчет количества микроорганизмов проводили методом предельных разведений испытуемых вод или болтушек на элективных средах в двух-трехкратных повторностях.

Получение накопительной культуры для выделения культуры в колбы Эрленмейра на 100мл вносили 30мл стерильной среды Сильвермана и Лундгрена 9К и пробы рудничной воды или руды из месторождений сульфидных руд, затем инкубируют при 30ºС до появления роста. О развитии бактерии судили по появлению бурой окраски среды, вызванной образованием соединении трехвалентного железа.

Для выделения культуру A.ferrooxidans в колбу Эрленмейера емкостью 250 мл вносили среду Сильвермана и Лундгрена 9К в объеме 150 мл. Затем добавляли пробы руды из месторождений сульфидных руд, инкубировали при 30ºС до появления роста для выделения штаммов бактерии, активных в окислении сульфидных минералов и устойчивых к ионам тяжелых металлов, использовали также сульфидные минералы.

Для количественного учета A.ferrooxidans, содержащихся в 1 г использовали метод кратных разведений. При исследовании рудного субстрата навеску измельчали в гомогенизаторе и растирали в ступке и готовили исходную взвесь в разведении 1:10. Из полченной взвеси или исходного жидкого материала готовили ряд последующих разведений с таким расчетом чтобы при посеве двух последних разведений на чашке Петри агаре выросло от 50 до 300 колоний.

Определение Fe+2 и Fe+3 проводилось объемным трилонометрическим методом в пробах, основанным на образовании комплекса трехвалентного железа с сульфосалициловой кислотой, который окрашивается в малиновый цвет. Содержание железа в растворах варьировало в диапазоне 0,1-10 г/дм3.

Учет Th.thiooxidans вели по появлению неисчезающей мути и оседанию серы, по образованию пленки серы, подкислению среды и другим специфическим признакам на среде Ваксамана (г/л): (NH4)2SO4–3,0; КН2РО4–3,0; MgSO4·7H2O–0,5; CaCl2·6H2O–0,25; Fe2SO4·7H2O–3,0; серный цвет (Sº) – 10; H2O–1,0 л, рН 4,0. 

Для количественного учета аммонификаторов использовали пептонную воду (г/дм3 водопроводной воды): пептон – 10; NaCl – 0,5. 

Для подсчета азотфиксирующих бактерий производили высев 0,25 г пробу руды на среду Эшби. О наличии азотобактерий в исследуемом материале судили по образованию характерных колоний вокруг песчинок. Производили подсчет количества колоний на чашке в пересчете на 1 г руды. Сапрофитные бактерии учитывали на мясопептонном агаре.

Результаты исследования и их обсуждение

Первичная идентификация была осуществлена на основании определителя Берги, в котором тионовые бактерии относятся к организмам, метаболизирующим серу и ее соединения и отнесены к родам с неясным систематическим положением, представленным 6 родами и 17 видами [2].

При идентификации оценивали такие признаки как используемый источник энергии, наличие капель серы в клетке или среде, форма клетки, наличие жгутиков. Выделенные бактерии были представлены палочковидными клетками, размножались путем поперечного деления, двигались при помощи единственного полярного жгутика. Окраска клеток по Грамму у всех выделенных штаммов была отрицательной. Бактерии энергично окисляли соединения закисного железа в условиях экстремально кислых значений рН (1,5). Учитывая их распространение в пробах руды месторождения с содержанием пирита (FeS2), источником энергии для этих бактерий также служили сульфиды. Диагностические признаки приведены в таблице 1.

Рост культур на лабораторных средах отмечен в поверхностных горизонтах культуральной среды, на основании чего был сделан вывод об облигатно автотрофном типе метаболизма. В процессе длительного культивирования выделенных бактерий происходила иммобилизация клеток на стенках сосудов, в результате чего их активность по окислению двухвалентного железа возрастала. Отмечено накопление серы в нижних горизонтах культуральной жидкости в виде светло-желтых отложений. Встречались в шахтных водах и рудном теле месторождения Бакырчик в пробах со слабокислой реакцией среды. В процессе пересевов на среду Сильвермана и Лундгрена 9К бактерии быстро адаптировались к лабораторному составу среды. на твердых средах с закисным железом вырастали мелкие колонии с ровными краями, с коричневыми вкраплениями гидрата окиси железа в центре. Колонии легко снимались с агара, однако плохо поддавались пересевам на твердые среды, поэтому все культуры поддерживали на жидкой среде Сильвермана и Лундгрена 9К. Поскольку источником углерода является СО2, то для поддержания культур необходимым условием являлось насыщение среды воздухом, а не чистым кислородом. При обеспечении перечисленных условий культура окисляла за сутки практически все железо, содержащееся в среде с повышением значений окислительно-восстановительного потенциала до 700-760 мВ.

По совокупности перечисленных признаков все шесть культур бактерий были отнесены к виду Acidithiobacillus ferrooxidans. Отсутствие видового разнообразия выделенных штаммов можно объяснить сравнительно небольшим набором диагностических признаков, рекомендованных в определителе. В последние годы список видов тионовых бактерий значительно пополнился в результате использования молекулярно-генетической идентификации бактерий на основании анализа нуклеотидной последовательности 16S rRNA гена. Сообщается о новых видах Leptospirillum ferriphilum, выделенных из дренажных вод, а также о важной роли Ferroplasma spp. при кучном выщелачивании упорных руд [3,5]. Интерес представляют термофильные ацидофилы Acidianus brierleyi (archaeron), выщелачивающие медь из энаргита (Cu2AsS4) [4]. В связи с этим после детального изучения свойств выделенных штаммов и подтверждения их положительного влияния на выщелачивание благородных металлов из упорной руды месторождения Бакырчик будет проведена молекулярно-генетическая идентификация бактерий.

Идентификационные признаки выделенных ацидофильных бактерий

Заключение

В результате выполненной работы были сделаны следующие выводы:

Из образцов шахтных вод и пород рудного тела с повышенным количеством тионовых бактерий были получены накопительные культуры, из которых выделено 6 чистых культур тионовых бактерий. Предварительная идентификация выделенных бактерий по способности окислять закисное железо и соединения серы, а также аэробному автотрофному метаболизму позволила отнести их к виду Acidithiobacillus ferrooxidans.