Вопрос целенаправленного формирования и поддержания здоровья организма человека в условиях возрастающих изменений окружающей среды и образа жизни современного общества следует отнести к разряду первостепенных [1, 2]. Стрессовые ситуации – постоянные спутники человеческой жизни. Стресс-реакция является адаптивным механизмом, направленным на поддержание стабильности физического и психического функционирования организма в ответ на воздействие стрессора [3-5]. Однако стресс не всегда является адаптивной реакцией. Некоторые физиологические реакции стресса являются полезными на протяжении короткого времени и неблагоприятными в долгосрочной перспективе [6, 7]. В связи с вышеизложенным, целью настоящего исследования явилось изучение влияния эмоционального стресса и прерывистой гипоксии на поведенческие реакции крыс.
Материал и методы исследования. Работа выполнена в рамках международного проекта «Изучение гематоксического влияния тяжелых металлов и возможности активации защитно-приспособительных механизмов организма при помощи нормо- и гипобарической гипоксии у взрослых и старых животных в сравнении» (научный руководитель проф. А.А. Аканов) при финансовой поддержке Министерства образования и науки Республики Казахстан
Эксперименты выполнены на 40 белых крысах-самцах массой 180-220 г., содержавшихся в стандартных условиях вивария на обычном пищевом рационе. Проведены 4 серии экспериментов: 1 серия – молодые интактные животные (контроль); 2 серия – молодые животные, подвергавшиеся иммобилизационному стрессу; 3 серия – молодые интактные животные (контроль); 4 серия – молодые животные, подвергавшиеся воздействию нормобарической гипоксии. В каждой серии было по 10 животных. Воздействие нормобарической гипоксии продолжали в течение 21 суток экспозицией один час. Модель нормобарической гипоксии создавали при помощи гипоксикатора, дозирующего поступление атмосферного воздуха с 10 % содержанием кислорода. Для этого гипоксикатор присоединяли шлангом к баллону с азотом, второй шланг присоединяли с ящиком (с выходным вентилляционным отверстием) куда помещали опытных животных. Объем ящика был специально рассчитан на количество помещаемых крыс. Иммобилизационный стресс моделировали при помощи пластиковой камеры, ограничивающей движение, куда помещали животное ежедневно по 30 мин. в течение недели. Изучение поведенческих реакций опытных крыс проводилось в тесте «открытого поля». Исследования проводились с соблюдением норм и правил проведения экспериментов с участием животных (решение ЛЭК КазНМУ им. С.Д. Асфендиярова протокол №2 от 18.04.2013 г.).
Процедуры статистического анализа выполнялись с помощью ППП SPSS-16. Критическое значение уровня статистической значимости при проверке нулевых гипотез принималось равным 0,05, либо 0,1. В случае превышения достигнутого уровня значимости статистического критерия этой величины, принималась нулевая гипотеза.
Результаты и обсуждение. Оценку эмоционального состояния, двигательную и исследовательскую активность экспериментальных животных изучали по характеру их поведения в тесте «открытого поля». В качестве поведенческих феноменов в открытом поле регистрировали горизонтальную двигательную активность по количеству пересеченных квадратов, вертикальную активность по числу подъемов на задние лапы с опорой и без опоры, эмоциональный статус по количеству дефекационных болюсов и умываний, исследовательский интерес по количеству актов «обнюхи-ваний».
В первом опытном сеансе под воздействием стресса у молодых крыс по сравнению с интактными животными статистически значимо сокращалось время первого передвижения (z=-2,226, р=0,026) (табл. 1).
Таблица 1
Основные статистические показатели поведенческих реакций молодых интактных крыс
в тесте «открытого поля», подвергавшихся иммобилизационному стрессу
|
Показатель |
Контроль |
Wilkoxon 2 –Sample Test |
Стресс |
Wilkoxon 2 –Sample Test |
||||
|
N |
Me |
25 %-75 % |
N |
Me |
25 %-75 % |
|||
|
Выработка |
||||||||
|
Латент.период выхода |
10 |
2 |
2-7 |
10 |
1 |
1-1 |
0,026** z=-2,226 |
|
|
Кол-во наружных квадр. |
10 |
19 |
7-44 |
10 |
5 |
2-22 |
0,397** |
|
|
Кол-во стоек на зад.лапы |
10 |
4 |
2-5 |
10 |
0 |
0-3 |
0,046** z=-1,997 |
|
|
Длит.стоек без опоры |
10 |
7 |
3-9 |
10 |
0 |
0-6 |
0,046** z=-02046 |
|
|
Кол-во обнюхиваний |
10 |
8 |
7-12 |
10 |
59 |
14-125 |
0,028** z=-2,197 |
|
|
Проверка |
||||||||
|
Латент.период выхода |
10 |
1 |
1-1 |
0.026* z=-2,226 |
10 |
1 |
1-2 |
0,414* 0,206** |
|
Кол-во наружных квадр. |
10 |
17 |
10-32 |
0,726* |
10 |
3 |
2-8 |
0,116* 0,043** z=-2,028 |
|
Кол-во стоек на зад.лапы |
10 |
1 |
1-4 |
0,084* |
10 |
0 |
0-1 |
0,157* 0,026** z=-2,226 |
|
Длит.стоек без опоры |
10 |
3 |
2-8 |
0,395* |
10 |
0 |
0-3 |
0,180* 0,027** z=-2,207 |
|
Кол-во обнюхиваний |
10 |
59 |
14-125 |
0,028* z=-2,197 |
10 |
36 |
12-60 |
0,176* 0,028** z=-2,197 |
|
Примечание. * – статистическая значимость по отношению к выработке; ** – к контролю. |
||||||||
При этом по сравнению с интактными у стрессированных крыс было почти в 4 раза меньшее число пересеченных наружных квадратов (Р>0,05). Эти крысы практически не совершали вертикальных стоек без опоры
(z=-1,997, р=0,046). Тогда как по сравнению с интактными крысами существенно увеличивалось количество актов «обнюхиваний» (Ме=59, интерквартильный размах от 14 до 125, z=-2,197, р=0,028), что в совокупности с вышеприведенным угнетением горизонтальной и вертикальной двигательно-исследовательской активности, по-видимому, может свидетельствовать об эмоциональности и тревожности стрессированных молодых крыс.
Во втором опытном сеансе у стрессированных особей также как и в первом нарушались как горизонтальная (z=-2,028, р=0,043), так и вертикальная (z=-2,226, р=0,026) двигательно-исследовательские активности. Крысы практически не передвигались по полю и почти не совершали попыток вставать на задние лапы. Зарегистрированное количество стоек с опорой, также как и их длительность были в 2 раза меньшими по сравнению с интактными крысами (z=-2,003, р=0,045 и z=-2,047, р=0,041). Тревожное состояние и беспокойство, судя по количеству актов «обнюхиваний», оставалось на достаточно высоком уровне и по сравнению с интактными крысами имело статистически значимое отличие (z=-2,197, р=0,028) (табл. 1).
Гипоксическая тренировка интактных крыс оказывала заметное влияние на когнитивные функции головного мозга. Изучение поведения животных в тесте «открытого поля» показало неоднозначные изменения количественных характеристик показателей теста у животных, подвергавшихся изолированному воздействию нормобарической гипоксии. Так, во время выработки показателей поведенческих реакций эти животные продемонстрировали низкий уровень эмоциональной реакции при помещении их в незнакомую среду, о чем судили по среднему количеству болюсов (М=0,4, 95 % ДИ от -0,1 до 0,9 против контроля М=2,6, 95 % ДИ от 0,8 до 4,5, р=0,017 z=-2,379) (табл. 2).
Таблица 2
Распределение средних показателей поведенческого акта «количество болюсов»
у контрольных животных и у животных, подвергавшихся воздействию нормобарической гипоксии
|
Показатель поведенческого акта |
Контроль |
Wilkoxon 2 –Sample Test |
Гипоксия |
Wilkoxon 2 –Sample Test |
||||
|
N |
Mean |
95 % ДИ |
N |
Mean |
95 % ДИ |
|||
|
Выработка |
||||||||
|
Кол-во болюсов |
10 |
2,6 |
0,8-4,5 |
- |
10 |
0,4 |
-0,1-0,9 |
0,017** z=-2,379 |
|
Проверка |
||||||||
|
Кол-во болюсов |
10 |
0,9 |
0,1-1,7 |
0,039* z=-2,060 |
10 |
1,0 |
-0,2-2,2 |
0,366* 0,480** |
|
Примечание. * – по Wilkoxon 2 –Sample Test статистическая значимость по отношению к выработке, ** – по отношению к контролю |
||||||||
Как в первом, так и во втором опытном сеансах у них практически полностью отсутствовала реакция замирания (фризинг), рассматриваемая как показатель сильного стресса, тогда как у контрольных крыс медиана и интерквартильный размах «времени фризинга» в первом опытном сеансе составляли 124 и 97,2-149,5 (р=0,012), а во втором – 52 и 25-63,2 (р=0,012) (табл. 3).
Таблица 3
Распределение средних показателей поведенческих актов «время фризинга», «количество наружных квадратов» и «время в центре» у контрольных животных и у животных, подвергавшихся воздействию нормобарической гипоксии
|
Показатель |
Контроль |
Wilkoxon 2 –Sample Test |
Гипоксия |
Wilkoxon 2 –Sample Test |
||||||
|
N |
Me |
25 % |
75 % |
N |
Me |
25 % |
75 % |
|||
|
Выработка |
||||||||||
|
Время фризинга |
10 |
124,0 |
97,2 |
149,5 |
10 |
0 |
0 |
0,25 |
0,012** z=-2,521 |
|
|
Кол-во наружных квадр. |
10 |
16,0 |
7,2 |
16 |
10 |
14,5 |
12,2 |
24,8 |
0,528** |
|
|
Время в центре |
10 |
1,5 |
1 |
4,5 |
10 |
2,5 |
1 |
5,5 |
0,271** |
|
|
Проверка |
||||||||||
|
Время фризинга |
10 |
52,0 |
25,0 |
63,2 |
0,012* |
10 |
0 |
0 |
0,25 |
0,285* 0,012** z=-2,524 |
|
Кол-во наружных квадр. |
10 |
17 |
10,2 |
25,5 |
0,207* |
10 |
22 |
15,8 |
35,5 |
0,005* z=-2,810 0,128** |
|
Время в центре |
10 |
2 |
2 |
3 |
1,0* |
10 |
3,5 |
1 |
8 |
0,066* 0,049** z=-1,973 |
|
Примечание. * – по Wilkoxon 2 –Sample Test статистическая значимость по отношению к выработке, ** – по отношению к контролю. |
||||||||||
Показатели кроссинга (количество пересеченных наружных квадратов) у крыс с гипокситерапией в первом опытном сеансе не отличались от показателей контрольных крыс (Ме=14,5, интерквартильный размах от 12,2 до 24,8 против Ме=16, интерквартильный размах от 7,2 до 16 контроля). Тогда как во втором опытном сеансе отмечалось увеличение этого показателя по сравнению с выработкой на 51,7 % (р=0,005, z=-2,810) и на 29,4 % по сравнению с контролем.
К этому сроку исследования у опытных крыс, подвергавшихся воздействию нормобарической гипоксии, статистически значимо повышалось и время нахождения в центре поля на 75 % (р=0,049, z=-1,973) по сравнению с контролем и на 40 % по отношению к предыдущему сроку исследования, что характеризует в поведении этих животных высокую скорость привыкания к новой обстановке.
Однако, судя по данным табл. 4, у этих крыс отмечалась тенденция уменьшения суммарной вертикальной двигательной активности в оба срока исследования. Так, они не совершили ни одной попытки стойки на задние лапы, как без опоры, так и с опорой.
Таблица 4
Распределение средних показателей вертикальной двигательной активности у контрольных животных
и у животных, подвергавшихся воздействию нормобарической гипоксии
|
Показатель поведенческого акта |
Контроль |
Wilkoxon 2 –Sample Test |
Гипоксия |
Wilkoxon 2 –Sample Test |
||||||
|
N |
Me |
25 % |
75 % |
N |
Me |
25 % |
75 % |
|||
|
Выработка |
||||||||||
|
Кол-во стоек на задние лапы |
10 |
3,5 |
0,2 |
9 |
10 |
0 |
0 |
1,0 |
0,058** |
|
|
Длит. стоек без опоры |
10 |
10 |
0,5 |
16 |
10 |
0 |
0 |
2,0 |
0,046** z=-1,992 |
|
|
Кол-во опор на стенку |
10 |
12,5 |
7,5 |
18,8 |
10 |
0 |
0 |
5,0 |
0,012** z=-2,524 |
|
|
Длит.опоры на стенку |
10 |
25,5 |
7,0 |
52,0 |
10 |
0 |
0 |
9,0 |
0,012** z=-2,524 |
|
|
Проверка |
||||||||||
|
Кол-во стоек на задние лапы |
10 |
3,5 |
2,2 |
5,0 |
0,279* |
10 |
0 |
0 |
2,2 |
0,197* 0,107** |
|
Длит. стоек без опоры |
10 |
8,0 |
7,2 |
10,5 |
0,671* |
10 |
0 |
0 |
4,0 |
0,317* 0,027** z=-2,217 |
|
Кол-во опор на стенку |
10 |
8,5 |
7,2 |
11,5 |
0,107* |
10 |
0 |
0 |
2,2 |
0,276* 0,018** z=-2,217 |
|
Длит.опоры на стенку |
10 |
6,0 |
2,5 |
16,2 |
0,043* z=-2,028 |
10 |
0 |
0 |
6,8 |
0,465* 0,028** z=-2,201 |
|
Примечание. * – по Wilkoxon 2 –Sample Test статистическая значимость по отношению к выработке, ** – по отношению к контролю. |
||||||||||
В условиях эмоционального стресса, возникающего при помещении в незнакомую обстановку, у животных в безвыходной конфликтной ситуации возникает «замещающее» поведение в виде груминга. Так, крысы с гипокситерапией предпочитали больше времени уделять гигиеническому ритуалу, о чем судили по увеличению акта груминга, продолжительность которого в оба срока исследования на 67,8 % (р=0,012) и 53,6 % (р=0,06) соответственно превышала время груминга контрольных крыс. Исходя из предшествовавшего поведения крыс, как то: низкий уровень тревожности и эмоциональности, нарастание кроссинга, задержка в центре поля, мы вправе придать адаптивное значение акту «груминга», т.к. по характеру поведения он близок к состоянию комфорта и покоя.
Таким образом, анализ поведенческого репертуара крыс в тесте «открытого поля» позволяет сделать следующие выводы:
• иммобилизационный стресс у молодых животных вызывал существенные сдиги в поведенческих реакциях, выразившиеся в угнетении двигательно-исследовательской деятельности и в развитии выраженного беспокойства и тревожности;
• гипоксическая тренировка, по-видимому, повышает у крыс способность к поведенческой саморегуляции, тем самым оказывая адаптивное влияние.