Триазавирин – оригинальное отечественное лекарственное вещество противовирусного действия. Ведется разработка твердых лекарственных форм препарата. На сегодняшний момент зарегистрирована капсулированная форма триазавирина. Одним из этапов создания лекарственных препаратов является разработка методов его качественного и количественного анализа. Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) широко применяется в фармацевтическом анализе благодаря своей высокой чувствительности и эффективности разделения, мягким условиям анализа, автоматизации проведения испытаний [2, 4]. Цель исследования – подтвердить возможность использования обращено-фазовой жидкостной хроматографии для определения триазавирина в капсулированной лекарственной форме.
Хроматографический эксперимент проводился на хроматографе «Agilent 1200», снабженном спектрофотометрическим детектором на диодной матрице.
Условия хроматографирования триазавирина:
1) хроматографические колонки Zorbax eclipse XDB C18 5 мкм 4.6·150 мм и Separon SGX NH2 7мкм 4,6·250;
2) элюент «ацетонитрил-0,025М водный раствор ацетата натрия» в соотношении 10:90 по объему при использовании обеих колонок;
3) расход элюента 850 мкл/мин;
4) длина волны детектирования 215 нм;
5) объем пробы 5 мкл;
6) проба: 0,025 г (точная навеска) модельной смеси, растворенной в 25 мл элюента;
7) температура окружающей среды 22 ±2 °С.
Обсуждение результатов. Пригодность хроматографических колонок для количественного определения триазавирина.
Первоначально проводился выбор хроматографической колонки по разделяющей эффективности. Для каждой из них рассчитывалось число теоретических тарелок (ЧТТ) как функция времени удерживания и ширины пика основного компонента (табл. 1) [4].
Таблица 1
Эффективность хроматографических колонок
|
Хроматографическая колонка |
Zorbax eclipse XDB C18 5 мкм 4.6*150 мм |
Separon SGX NH2 7мкм 4,6*250 |
|
Эффективность,N |
34438 |
19600 |
|
Разрешение,R |
38,22 |
16,52 |
Эффективность хроматографической колонки N, рассчитанная по пику основного компонента (триазавирин), должна быть не менее 3500 теоретических тарелок, разрешение R между пиком 3-метилтио-5-амино-1,2,4-триазола (основная примесь) и пиком триазавирина должно составлять не менее 5,0 мин. [3].
Дальнейшая апробация методики количественного определения триазавирина в капсулированной форме проводилась на хроматографической колонке Zorbax eclipse XDB C18, как наиболее эффективной. Колонка Separon SGX NH2 оказалась непригодна для анализа триазавирина из-за нестабильности, в сторону уменьшения времен удерживания.
Определение метрологических характеристик методики количественного определения триазавирина. Точность аналитической методики (precision) оценивалась по сходимости результатов (precision) определения триазавирина в модельных смесях в концентрации, близкой к номинальной (0,25 г). Исследовалось 5 растворов триазавирина, приготовленных независимо друг от друга в соответствии с тестируемой методикой. Каждый раствор хроматографировали 3 раза. По результатам эксперимента определялись следующие метрологические характеристики сходимости методики: средний результат (xср), относительное стандартное отклонение (srср), относительный доверительный интервал среднего результата (εср), средняя относительная погрешность определения (erср). Расчетное значение t-критерия Стьюдента должно быть меньше табличного или srср ≤2,0 % (табл. 2) [1, 5].
Таблица 2
Определение точности методики количественного определения триазавирина
|
№ р-ра |
Площадь пика, S |
Xiср,г |
Хср,г |
srср, % |
εср |
erср, % |
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
|
1 |
1238,097 1231,887 1243,201 |
0,2627 |
0,2566 |
1,59 |
0,009 |
3,5 |
|
2 |
1186,699 1193,708 1198,989 |
0,2584 |
||||
|
3 |
1198,971 1204,093 1203,003 |
0,2527 |
||||
|
4 |
1214,503 1202,053 1209,061 |
0,2557 |
||||
|
5 |
1168,424 1169,408 1160,365 |
0,2534 |
Аналитическая методика определения триазавирина признана точной по критерию сходимости результатов.
Особое внимание уделялось определению линейности методики (linearity)– способности методики в диапазоне применения давать величины сигнала Yi (площадь пика) прямо пропорциональные концентрации Сi определяемого вещества. Для оценки линейности готовилось 7 растворов с концентрациями триазавирина, охватывающими всю область действия методики (60-135 %)[5]. Данные позволяют судить о стойкой линейной зависимости между показателями концентраций триазавирина и площадями пиков (рисунок).
Корреляция концентраций триазавирина и площади пиков. R=0,99553
Вывод
Подтверждена возможность количественного определения триазавирина по выбранной аналитической методике на жидкостном хроматографе серии «Agilent 1200».