Scientific journal
Modern high technologies
ISSN 1812-7320
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,899

INVESTIGATION OF INTRACELLULAR LOCALIZATION OF PROTEOLYTIC ENZYMES AND THEIR PROTEIN INHIBITORS IN EGGS OF SILKWORM

Yarygin D.V. Krylova I.D. Konichev A.S. Filippovich Yu.B.
Intracellular localization of serine, cysteine and aspartic proteinases and their protein inhibitors in eggs of silkworm during postdiapause stage of its embryonic development is studied. It is shown that the activity of protein inhibitors and certain peptidohydrolases in subcellular fractions has correlated character. It provides for co-ordination and fine regulation of functioning of proteolytic enzymes complex. Possible functions of proteinase protein inhibitors in subcellular structures of silkworm are discussed.
Внутриклеточная локализация протеолитических ферментов и их белковых ингибиторов в тканях и органах животных изучена в той или иной степени [2, 5, 8, 14, 22]. Однако, эти работы, в основном, сосредоточены на исследовании субклеточных фракций тканей позвоночных животных. Установлено, что белковые ингибиторы позвоночных локализованы в клетке в зависимости от выполняемых функций в ядерной, митохондриальной и лизосомальной фракциях, в эндоплазматическом ретикулуме, цитозоле, плазматической мембране и в других субклеточных структурах [3, 12, 15, 17, 18].

Данные о субклеточном распределении протеолитических ферментов и их белковых ингибиторов в тканях и органах насекомых крайне ограничены [9, 11, 19, 20, 21]. Исследование динамики активности пептидогидролаз и их белковых ингибиторов у насекомых в процессе их развития демонстрирует определяющую роль белковых ингибиторов протеиназ в регуляции протеолиза в онтогенезе насекомых [6]. Существенную информацию о функциональной роли белковых ингибиторов представляет изучение субклеточной локализации пептидогидролаз и их белковых ингибиторов.

В настоящей работе предпринято исследование субклеточной локализации пептидогидролаз и их белковых ингибиторов в грене тутового шелкопряда.

Изучение динамики активности пептидогидролаз и их белковых ингибиторов в грене тутового шелкопряда в процессе ее развития продемонстрировало определяющую роль белковых ингибиторов протеиназ в регуляции протеолиза в эмбриогенезе насекомого [7]. Существенную информацию о функциональной роли белковых ингибиторов в эмбриональном развитии тутового шелкопряда представляет изучение их субклеточной локализации.

Полученные результаты, характеризующие распределение активности исследованных протеиназ и их белковых ингибиторов с оптимумом рН 3,0; 3,6; 6,2; 7,2; 8,6 и 9,0 по субклеточным фракциям грены (рис. 1, 2), показали существенные различия в уровне активности протеолитических ферментов и их белковых ингибиторов между отдельными субклеточными фракциями яиц тутового шелкопряда, что свидетельствует о разнообразии функций, выполняемых ферментами и их ингибиторами в каждой из субклеточных cтруктур.

Максимальный уровень протеолитической активности исследованных аспартильных, кислых и слабокислых цистеиновых протеиназ (оптимум рН 3,0; 3,6 и 6,2), основной функцией которых является деградация запасных белков, главным образом характерен для лизосомальной фракции грены. Существенно меньший уровень активности обнаружен для ядерной и митохондриальной фракций грены (рис. 1). В литературе имеются сведения о наличии лизосомальных цистеиновых и аспартильных протеиназ в яйцах насекомых [1, 10, 16]. Существуют данные о нахождении цистеиновых протеиназ в ядерной и митохондриальной фракциях животных клеток [3, 4]. Присутствие пептидогидролаз в ядрах насекомых является достаточно хорошо установленным фактом [4].

Рис. 1. Распределение активности пепсиноподобных (а) (оптимум рН - 3,0), цистеиновых протеиназ (оптимум рН: (б) - 3,0; (в) - 3,6; (г) - 6,2; (д) - 8,6) и их белковых ингибиторов по субклеточным фракциям грены тутового шелкопряда.

Здесь и на рис. 2: Линия - протеолитическая активность; столбики - активность ингибиторов. По оси ординат: слева - активность ингибиторов, справа - протеолитическая активность (усл. ед / мг белка); по оси абсцисс - субклеточные фракции: 1 - исходный гомогенат, 2 - ядерная фракция, 3 - митохондриальная фракция, 4 - лизосомальная фракция, 5 - постлизосомальная фракция.

Рис. 2. Распределение активности химотрипсиноподобных (а) (оптимум рН 7,2), трипсиноподобных протеиназ (оптимум рН: (б) - 6,2; (в) - 9,0) и их белковых ингибиторов по субклеточным фракциям грены тутового шелкопряда.

Согласно литературным данным [9, 10], лизосомальные цистеиновые и аспартильные протеиназы (катепсино-B-подобные, катепсино-L-подобные и катепсино-D-подобные протеиназы) участвуют в расщеплении запасных белков (вителлин) в эмбриогенезе насекомых.

Наличие высокой активности аспартильных и цистеиновых протеиназ в митохондриальной фракции не является неожиданным фактом (рис. 1). Активность цистеиновых протеиназ была обнаружена в митохондриях желточных клеток артемии [13] и в митохондриях ооцитов сиговых рыб [2].

В последнее время появились сообщения о том, что митохондрии играют ключевую роль в апоптозе. Так, белок с молекулярной массой 50 кДа, являясь цистеиновой протеиназой, локализованной в митохондриях, в бесклеточной системе изолированных ядер вызывает конденсацию хроматина и межнуклеосомную фрагментацию ДНК, то есть индуцирует апоптоз [3].

В отличие от аспартильных и цистеиновых протеиназ, активность сериновых протеаз не обнаружена в субклеточных фракциях грены 4 дня постдиапаузного развития (рис. 2, б, в), так как их основная активность приходится на конец эмбрионального развития насекомого. Исключение составляют лишь химотрипсиноподобные протеиназы (оптимум рН 7,2), активность которых обнаружена в постлизосомальной фракции (рис. 2, а).

Существенно и то, что белковые ингибиторы кислых пептидогидролаз локализованы в тех же компартментах грены, что и протеолитические ферменты. При этом уровень активности белковых ингибиторов во всех случаях дополнителен по отношению к активности соответствующего энзима (рис.1), что доказывает наличие функциональной связи между ними.

Известно, что в ядрах насекомых и млекопитающих обнаружены комплексы протеаза-ингибитор. Такие комплексы описаны для цистеиновых протеиназ (каспаз). Цистеиновая протеиназа связывается ковалентно с ингибитором через дисульфидную связь [3]. Резкое преобладание активности белковых ингибиторов аспартильных, цистеиновых и сериновых протеиназ в ядерной фракции грены (рис. 1, 2); свидетельствует на наш взгляд, о возможном участии ингибиторов пептидогидролаз в поддержании структуры и целостности ядер, т. к. протеолитическое расщепление их структурных и функциональных белков приводит к нарушению структурной организации органелл, к разбалансировке упорядоченных биохимических реакций в них и в итоге к фрагментации ДНК и гибели клеток.

Таким образом, ядерные белковые ингибиторы протеаз грены тутового шелкопряда, возможно, принимают участие в регуляции механизмов процесса клеточной гибели (апоптоза).

Наличие высокой активности белковых ингибиторов цистеиновых и аспартильных протеиназ в митохондриальной фракции (рис. 1), по-видимому, связано с присутствием в этом компартменте соответствующих протеиназ и с защитой структурных и функциональных белков от протеолитического действия этих энзимов.

Локализация белковых ингибиторов протеиназ в лизосомальной фракции свидетельствует об участии этих белков в процессах регуляции гидролиза запасных белков желтка в ходе эмбрионального развития тутового шелкопряда. Так, высокий уровень активности пептидогидролаз в лизосомах, участвующих в деградации запасных белков, объясняется незначительной активностью белковых ингибиторов протеиназ в этих субклеточных структурах.

Таким образом, приведенные выше экспериментальные данные о субклеточной локализации цистеиновых, аспартильных и сериновых протеиназ и их белковых ингибиторов в грене тутового шелкопряда; позволяют заключить, что основная функция белковых ингибиторов пептидогидролаз, состоящая в регуляции активности эндогенных протеиназ, реализуется в грене при осуществлении различных процессов, и, в том числе при защите внутриклеточных структурных и функциональных белков ядер и митохондрий от повреждающего действия протеиназ.


СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:

  1. Иванов В.Г. Белковый комплекс и протеолитические ферменты желточного содержимого грены тутового шелкопряда Bombyx mori L.: Автореф. дисс. ... канд. биол. наук. - М.: МПГИ, 1985. 14 с.
  2. Коновалов Ю.Д. // Успехи соврем. биологии. - 1986. - Т. 101. № 3. С. 359-373.
  3. Куцый Н. П., Кузнецова Е. А., Газиев А. И. // Биохимия. - 1999. - Т. 64. № 2. С. 149-163.
  4. Назаров А.Ю. Характеристика протеолитического комплекса ферментов хроматина тутового шелкопряда Bomyx mori L.: Автореф. дисс. ... канд. биол. наук. - М.: МПГУ, 1993. 14 с.
  5. Немова Н. Н. Внутриклеточные протеолитические ферменты у рыб. - Петрозаводск: КНЦ РАН, 1996. 104 с.
  6. Ярыгин Д.В. Изучение комплекса протеолитических ферментов и их белковых ингибиторов в грене тутового шелкопряда: Автореф. дисс. ... канд. биол. наук. - М.: МПГУ, 2000. 16 с.
  7. Ярыгин Д.В., Клунова С.М., Филиппович Ю.Б. // Онтогенез. - 2001. - Т. 32. № 4. С. 269-276.
  8. Chapman H. A., Riese R. I., Shi G. P. // Ann. Rev. Physiol. - 1997. - V. 59. P. 63-88.
  9. Cho W. L., Tsao S. M., Hays A. R., Walter R., Chen J. S., Shigirevskaya E. S., Raikhel A. S. // J. Biol. Chem. - 1999. - V. 274. №. 19. P. 13311-13321.
  10. Dittmer N. T., Raikhel A. S. // Insect Biochem. Molec. Biol. - 1997. - V. 27. №. 4. P. 323-335.
  11. Gan H., Wang Y., Jang H.B., Mita K., Kanost M.R. // Insect Biochem. and Molec. Biol. - 2001. - V.31. № 9. P. 887-898.
  12. Gburek J., Osada J., Siekierka M., Warwas M. // Compar. Biochem. Physiol. B. - 1995. - V. 112. №. 4. P. 697-701.
  13. Lu J., Warner A. H. // Biochem. Cell Biol. - 1991. - V. 69. №. 2-3. P. 96-101.
  14. Ohshita T., Kido H. // Anal. Biochem. - 1995. - V. 230. №. 1. P. 41-47.
  15. Spiess E., Bruning A., Gack S., Ulbricht B., Spring H., Trefz G., Ebert T. // J. Histochem. Cytochem. - 1994. - V. 42. №. 7. P. 917-929.
  16. Takahashi S.Y., Yamamoto Y., Shionoya Y., Kageyama T. // J. Biochem. - 1993. - V. 114. № 2. P. 267-272.
  17. Vasilev A. V., Gutkin D. V., Dankova T. G., Vorobeichik T. A., Tutelyan V. A. // Voprosy meditsinskoi khimii. - 1991. - V. 37. №. 6. P. 89-91.
  18. Wakayama T., Iseki Sh. // Acta Histochem. Cytochem. - 1997. - V. 30. №. 5-6. P. 557-565.
  19. Yamahama Y., Uto N., Tamotsu S., Miyata T., Yamamoto Y., Watabe S., Takahashi S.Y. // J. Insect Physiol. - 2003. - V. 49. №. 2. P. 131-140.
  20. Yang X.M., Hou L.J., Dong D.J., Shao H.L., Wang J.H., Zhao X.F. // Arch. Insect Вiochem. Physiol. - 2006. - V. 62. № 1. P.1-10.
  21. Zhao X.F., An X.M, Wang J.H., Dong D.J., Du X.J., Sueda S., Kondo H. // Arch. Insect biochem. Physiol. - 2005. - V. 58. № 1. P.39-46.
  22. Zhivotovsky B., Nicotera P., Orrenius S. // Cell Proliferat. - 1995. - V. 28. №. 4. P. 172.