Один из белков фетоплацентарного комплекса - альфа-фетопротеин человека включен во многие процессы, связанные с ростом и клеточной дифференцировкой. Ранее мы выдвинули предположение о том, что продукты спонтанной протеолитической деградации альфа-фетопротеина и, возможно, некоторых других белков фето-плацентарного комплекса оказывают регулирующее влияние на иммунную систему человека. В частности за счет пептидов из альфа-фетопротеина вполне может осуществляется контроль за иммунологической толерантностью. Ранее нами (Терентьев А.А., 1997; Терентьев и соавт., 1999, 2000, 2002, 2004) был выявлен биологически активный сайт в структуре альфа-фетопротеина (АФП), соответствующий последовательности с 14 по 20 аминокислотных остатков первичной структуры АФП. Предварительные исследования (Терентьев А.А. и соавт., 1999, 2001, 2003, 2005) продемонстрировали иммуномодуляторную активность синтетического пептида, соответствующего этой последовательности с возможным участием механизмов апоптоза в реализации его иммуномодуляторной активности.
Состояние иммунологической толерантности во многом определяется вхождением в апоптоз (программированную клеточную гибель) активированных лимфоцитов. Наиболее естественный путь удаления из организма активированных лимфоцитов способных к синтезу и секреции провоспалительных цитокинов это путь их активационного апоптоза. Активационный апоптоз лимфоцитов развивается как естественное завершение активационного (дифференцировочного) процесса в ходе, которого на поверхности лимфоцитов последовательно экспрессируются рецепторы CD25, CD71, HLA-DR и CD95. CD95 - маркер готовности лимфоцитов к запуску активационного апоптоза. Система взаимодействующих рецепторов Fas(CD95) и FasL(CD178) - важнейший механизм активационной элиминации лимфоцитов, благодаря включению которого удаляется большинство лимфоцитов после выполнения ими возложенный на них функций.
Fas-FasL взаимодействие, запускающее активационный апоптоз, играет роль в торможении иммунного ответа, путем удаления активированных аутореактивных лимфоцитов и, тем самым, служит защитой от аутоиммунных реакций, поддерживая толерантность организма.
Существо ответной иммунной реакции организма заключается в пролиферативных и дифференцировочных процессах в лимфоцитах. Эта реакция поддерживает гомеостаз организма и, вместе с тем, может приводить к иммунопатологическим заболеваниям, при нарушении механизмов толерантности. За настройку иммунного ответа и одновременно его торможение отвечает активационный процесс в лимфоцитах, который направлен на образование зрелых клеточных форм. После выполнения возложенных на них функций зрелые лимфоциты удаляются из организма с подключением механизмов активационного апоптоза. Ведущий процесс элиминации лимфоцитов заключается в их активационно-индуцированной программированной клеточной гибели.
Изучение механизмов, при помощи которых поверхностные рецепторы Fas и FasL регулируют гибель клеток, а также факторов, регулирующих их экспрессию, в сочетании с прямой регистрацией апоптоза лимфоцитов, может дать важную информацию для понимания гомеостаза, в иммунной системе для разработки новых подходов в лечении различных заболеваний.
Цель исследования состояла в определении влияния синтетического фрагмента АФП14-20 на экспрессию активационных рецепторов лимфоцитов, также определения апоптоза лимфоцитов у больных атопической бронхиальной астмой.
Методы исследования. Все исследования выполнены на лимфоцитах периферической крови больных атопической бронхиальной астмой - 7 пациентов, а также 20 лимфоцитах здоровых доноров. Лимфоциты больных в период обострения заболевания представляют модель клеточного пролиферативного процесса с ограниченным входом в активационный или, CD95-индуцированный апоптоз. Лимфоциты выделяли в одноступенчатом градиенте плотности, а затем, используя метод непрямой иммунофлюоресценции, определяли популяционный и субпопуляционный состав лимфоцитов, а также экспрессию активационных антигенов лимфоцитов CD25, CD71, HLA-DR, CD95 (ИКО, Россия), CD95L (Caltag Laboratories, США).
Культивирование лимфоцитов проводили в стерильных условиях в минимальной среде 199 в атмосфере 5% CO2 в течение 16 ч при температуре 37о. Концентрация клеток в среде инкубации составляла 2,5 млн/мл. К культивируемым лимфоцитам добавляли синтетический пептид АФП14-20 (в конечной концентрации 10-8М) После окончания культивирования лимфоциты отмывали от пептида и подвергали процедуре иммунофенотипирования.
Определение апоптоза лимфоцитов включает в себя традиционную подготовку препарата лимфоцитов, фиксированных на стекле с помощью полилизина, обработку лимфоцитов FITC-мечеными моноклональными антителами и финальное окрашивание хроматина клеток пропидий иодидом. Для повышения проницаемости клеточных мембран для пропидий иодида применяли дигитонин, обеспечивающий необходимую проницаемость плазматической и ядерной мембран. Клетки, фиксированные на стекле, и обработанные моноклональными антителами для выявления поверхностных рецепторов, помещали в среду следующего состава: 0,1% цитрат калия, 0,75мМ NaCl, пропидий иодит 2 мкг/мл, дигитонин 20 нг/мл, рН 4,0. За 30 мин инкубации при 4оС развивается красно-оранжевое окрашивание нативных ядер клеток и темно-красное окрашивание ядер подверженных апоптозу. Темно-красное окрашивание апоптозирующихся ядер клеток объясняется небольшим количеством фосфодиэфирных связей в рестриктированной ДНК клеток, находящихся в процессе программируемой клеточной гибели. В ходе этого процесса светло-зеленое окрашивание мембраны клетки, вызванное окрашиванием поверхностных рецепторов, сохраняется, что позволяет отнести каждый лимфоцит к определенному клеточному типу, а с другой стороны, выявить, находится ли данная клетка в состоянии апоптоза.
Результаты исследования. Исследование синтетического пептида LDSYQCT, соответствующего фрагменту АФП14-20 проведено на лимфоцитах периферической крови 7 пациентов с диагнозом атопическая бронхиальная астма в период обострения заболевания. Диагноз подтвержден данными клинико-лабораторных исследований. Синтетический пептид LDSYQC(Асm)T получен методом твердофазного синтеза в лаборатории синтеза пептидов Кардиологического научного центра РФ сотрудниками Ж.Д. Беспаловой и Е.В. Кудрявцевой, где Acm - ацетоамидометильная защитная группа, прикрывающая SH-группу цистеина, защищая ее от окисления и димеризации по сере.
Результаты исследования влияния синтетического пептида LDSYQCT структурного фрагмента альфа-фетопротеина человека на экспрессию активационных антигенов лимфоцитов больных атопической бронхиальной астмой в сопоставлении с этими же параметрами здоровых доноров приведены в таблице.
Сопоставление иммунологических показателей здоровых доноров и больных, лимфоциты которых подвергали процедуре инкубации без добавления пептида (контроль) в целом подтверждает характерные изменения в экспрессии маркеров активации, выявленные ранее у этих больных. Так, при обострении заболевания, увеличено количество клеток экспрессирующих функциональные активационные антигены CD54(ICAM1) и CD23 в 2,5 - 3 раза, что свидетельствует о воспалении сопровождающемся интенсивным антителогенезом. Увеличение экспрессии CD54(ICAM1) интерпретируется как повышение готовности к миграции лимфоцитов и их участие в антигенной презентации. Увеличение экспрессии CD23, низкоаффинного рецептора для IgE, - свидетельство В-клеточной активации.
Количество лимфоцитов, экспрессирующих дифференцировочные активационные антигены CD25, HLA-DR, CD95, а также CD95L у больных увеличено примерно на 50% по сравнению со здоровыми донорами, что свидетельствует о средней тяжести заболевания.
Таблица 1. Активированные формы лимфоцитов при культивировании в присутствии синтетического пептида АФП14-20
|
Активационные антигены лимфоцитов |
Здоровые доноры |
Больные бронхиальной астмой |
|
|
аминокислотный контроль |
АФП14-20 опыт |
||
|
CD54(ICAM1) |
5,49±0,98% |
14,17±1,04% |
8,65±0,57%*** |
|
CD23 |
5,26±0,60% |
13,11±0,82% |
12,45±1,11% |
|
CD25 |
6,09±0,50% |
9,75±0,39% |
10,10±0,46% |
|
HLA-DR |
11,93±0,55% |
17,86±1,51% |
10,69±1,24%** |
|
CD95 |
4,64±0,34% |
6,44±0,64% |
13,19±0,99%*** |
|
CD95L |
9,22±1,04% |
13,85±1,09% |
17,13±1,59 |
Примечание: *-p<0,05; **-p<0,01; ***-p<0,001; достоверность различий указана для опытной группы по сравнению с контрольной.
Под влиянием АФП14-20 функциональные активационные антигены CD54(ICAM1) и CD23 испытывают разнонаправленные изменения. Так, количество лимфоцитов экспрессирующих CD54(ICAM1), молекулы межклеточной адгезии, достоверно снижается, что свидетельствует о торможении процессов миграции и антигенной презентации и указывает на противовоспалительный характер действия пептида. Однако, при этом, АФП14-20 не влияет на количество лимфоцитов, экспрессирующих рецептор CD23 и, следовательно, не влияет на В-клеточную активацию лимфоцитов.
Под влиянием АФП14-20 количество лимфоцитов, экспрессирующих дифференцировочные активационные антигены CD25, HLA-DR, CD95, а также CD95L изменяется в неодинаковой степени. Так пептид АФП14-20 не влияет на количество лимфоцитов, экспрессирующих ранний активационный антиген CD25 - рецептор к интерлейкину 2, что свидетельствует о его неспособности к торможению иммунной активации. Вместе с тем количество лимфоцитов, несущих поздний активационный антиген - рецептор HLA-DR под влиянием пептида существенно понижается практически до уровня здоровых доноров. А количество лимфоцитов несущих рецептор запуска активационного апоптоза - CD95 увеличивается более чем вдвое. При этом содержание лимфоцитов, экспрессирующих лиганд для рецептора CD95 - CD95L, имеет тенденцию к увеличению.
Влияние пептида АФП14-20 на лимфоциты, активированные воспалительным процессом у больных атопической бронхиальной астмой, наиболее выражено для двух поверхностных рецепторов - HLA-DR и CD95. Отношение HLA-DR/CD95 показывает насколько зрелые клеточные формы лимфоцитов преобладают над лимфоцитами, готовыми к вступлению на путь активационного апоптоза. Величина этого показателя, определённая у больных составляет 3,07±0,44, под влиянием пептида достоверно понижается до 0,86±0,12 p<0,001. Полученные результаты свидетельствуют о том, что готовность лимфоцитов, активированных воспалительным процессом к апоптозу под влиянием пептида АФП14-20, в целом, увеличивается, однако из этих данных неясно, насколько эта готовность реализуется. Ответ на этот вопрос был получен в следующих экспериментах.
Изучение апоптоза, развивающегося в CD95+-лимфоцитах, показало, что уровень апоптоза в CD95+-лимфоцитах больных составляет 31,51±3,16%. Под влиянием пептида количество лимфоцитов, несущих рецептор CD95 (CD95+-клетки) и находящихся в состоянии апоптоза, увеличивается до 64,30±5,66%, p<0,001. При этом количество CD95 позитивных лимфоцитов находящихся в состоянии апоптоза у здоровых доноров не менее 80%.
Заключение. Таким образом, исследуемый пептид АФП14-20 влияет на активационный процесс в лимфоцитах путем увеличения экспрессии рецептора запуска активационного апоптоза CD95, повышает апоптоз среди CD95+-лимфоцитах, что ведет к снижению количества зрелых HLA-DR+-клеток. В то же время, указанный пептид не предотвращает раннюю активацию лимфоцитов и не влияет на В-клеточную активацию и экспрессию рецептора, являющегося лигандом для CD95, т.е. CD95L. Молекулярный механизм действия усиления апоптоза лимфоцитов под влиянием пептида АФП14-20 может быть объяснен либо активацией внутриклеточных тирозинкиназ, вызывающих синтез рецептора CD95, либо действием пептида на уровне плазматической мембраны, вызывающим тримеризацию уже синтезированных субъединиц рецептора CD95.