Научный журнал
Современные наукоемкие технологии
ISSN 1812-7320
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,899

УСИЛЕНИЕ АПОПТОЗА CD95+-ЛИМФОЦИТОВ ПОД ВЛИЯНИЕМ СИНТЕТИЧЕСКОГО ПЕПТИДА ИЗ АЛЬФА-ФЕТОПРОТЕИНА ЧЕЛОВЕКА (АФП14-20)

Терентьев А.А. Порядин Г.В. Салмаси Ж.М. Александрова И.А. Тагирова А.К. Молдогазиева Н.Т. Казимирский А.Н.
Современные наукоемкие технологии в биологии и медицине базируются на фундаментальных исследованиях способных дать новые представления о ключевых процессах в организме. Фундаментальные исследования фетоплацентарных белков человека ведут к лучшему пониманию процессов роста и развития. На основе молекулярных структур, происходящих из этих белков, могут быть созданы новые лекарственные препараты и разработаны диагностикумы.

Один из белков фетоплацентарного комплекса - альфа-фетопротеин человека включен во многие процессы, связанные с ростом и клеточной дифференцировкой. Ранее мы выдвинули предположение о том, что продукты спонтанной протеолитической деградации альфа-фетопротеина и, возможно, некоторых других белков фето-плацентарного комплекса оказывают регулирующее влияние на иммунную систему человека. В частности за счет пептидов из альфа-фетопротеина вполне может осуществляется контроль за иммунологической толерантностью. Ранее нами (Терентьев А.А., 1997; Терентьев и соавт., 1999, 2000, 2002, 2004) был выявлен биологически активный сайт в структуре альфа-фетопротеина (АФП), соответствующий последовательности с 14 по 20 аминокислотных остатков первичной структуры АФП. Предварительные исследования (Терентьев А.А. и соавт., 1999, 2001, 2003, 2005) продемонстрировали иммуномодуляторную активность синтетического пептида, соответствующего этой последовательности с возможным участием механизмов апоптоза в реализации его иммуномодуляторной активности.

Состояние иммунологической толерантности во многом определяется вхождением в апоптоз (программированную клеточную гибель) активированных лимфоцитов. Наиболее естественный путь удаления из организма активированных лимфоцитов способных к синтезу и секреции провоспалительных цитокинов это путь их активационного апоптоза. Активационный апоптоз лимфоцитов развивается как естественное завершение активационного (дифференцировочного) процесса в ходе, которого на поверхности лимфоцитов последовательно экспрессируются рецепторы CD25, CD71, HLA-DR и CD95. CD95 - маркер готовности лимфоцитов к запуску активационного апоптоза. Система взаимодействующих рецепторов Fas(CD95) и FasL(CD178) - важнейший механизм активационной элиминации лимфоцитов, благодаря включению которого удаляется большинство лимфоцитов после выполнения ими возложенный на них функций.

Fas-FasL взаимодействие, запускающее активационный апоптоз, играет роль в торможении иммунного ответа, путем удаления активированных аутореактивных лимфоцитов и, тем самым, служит защитой от аутоиммунных реакций, поддерживая толерантность организма.

Существо ответной иммунной реакции организма заключается в пролиферативных и дифференцировочных процессах в лимфоцитах. Эта реакция поддерживает гомеостаз организма и, вместе с тем, может приводить к иммунопатологическим заболеваниям, при нарушении механизмов толерантности. За настройку иммунного ответа и одновременно его торможение отвечает активационный процесс в лимфоцитах, который направлен на образование зрелых клеточных форм. После выполнения возложенных на них функций зрелые лимфоциты удаляются из организма с подключением механизмов активационного апоптоза. Ведущий процесс элиминации лимфоцитов заключается в их активационно-индуцированной программированной клеточной гибели.

Изучение механизмов, при помощи которых поверхностные рецепторы Fas и FasL регулируют гибель клеток, а также факторов, регулирующих их экспрессию, в сочетании с прямой регистрацией апоптоза лимфоцитов, может дать важную информацию для понимания гомеостаза, в иммунной системе для разработки новых подходов в лечении различных заболеваний.

Цель исследования состояла в определении влияния синтетического фрагмента АФП14-20 на экспрессию активационных рецепторов лимфоцитов, также определения апоптоза лимфоцитов у больных атопической бронхиальной астмой.

Методы исследования. Все исследования выполнены на лимфоцитах периферической крови больных атопической бронхиальной астмой - 7 пациентов, а также 20 лимфоцитах здоровых доноров. Лимфоциты больных в период обострения заболевания представляют модель клеточного пролиферативного процесса с ограниченным входом в активационный или, CD95-индуцированный апоптоз. Лимфоциты выделяли в одноступенчатом градиенте плотности, а затем, используя метод непрямой иммунофлюоресценции, определяли популяционный и субпопуляционный состав лимфоцитов, а также экспрессию активационных антигенов лимфоцитов CD25, CD71, HLA-DR, CD95 (ИКО, Россия), CD95L (Caltag Laboratories, США).

Культивирование лимфоцитов проводили в стерильных условиях в минимальной среде 199 в атмосфере 5% CO2 в течение 16 ч при температуре 37о. Концентрация клеток в среде инкубации составляла 2,5 млн/мл. К культивируемым лимфоцитам добавляли синтетический пептид АФП14-20 (в конечной концентрации 10-8М) После окончания культивирования лимфоциты отмывали от пептида и подвергали процедуре иммунофенотипирования.

Определение апоптоза лимфоцитов включает в себя традиционную подготовку препарата лимфоцитов, фиксированных на стекле с помощью полилизина, обработку лимфоцитов FITC-мечеными моноклональными антителами и финальное окрашивание хроматина клеток пропидий иодидом. Для повышения проницаемости клеточных мембран для пропидий иодида применяли дигитонин, обеспечивающий необходимую проницаемость плазматической и ядерной мембран. Клетки, фиксированные на стекле, и обработанные моноклональными антителами для выявления поверхностных рецепторов, помещали в среду следующего состава: 0,1% цитрат калия, 0,75мМ NaCl, пропидий иодит 2 мкг/мл, дигитонин 20 нг/мл, рН 4,0. За 30 мин инкубации при 4оС развивается красно-оранжевое окрашивание нативных ядер клеток и темно-красное окрашивание ядер подверженных апоптозу. Темно-красное окрашивание апоптозирующихся ядер клеток объясняется небольшим количеством фосфодиэфирных связей в рестриктированной ДНК клеток, находящихся в процессе программируемой клеточной гибели. В ходе этого процесса светло-зеленое окрашивание мембраны клетки, вызванное окрашиванием поверхностных рецепторов, сохраняется, что позволяет отнести каждый лимфоцит к определенному клеточному типу, а с другой стороны, выявить, находится ли данная клетка в состоянии апоптоза.

Результаты исследования. Исследование синтетического пептида LDSYQCT, соответствующего фрагменту АФП14-20 проведено на лимфоцитах периферической крови 7 пациентов с диагнозом атопическая бронхиальная астма в период обострения заболевания. Диагноз подтвержден данными клинико-лабораторных исследований. Синтетический пептид LDSYQC(Асm)T получен методом твердофазного синтеза в лаборатории синтеза пептидов Кардиологического научного центра РФ сотрудниками Ж.Д. Беспаловой и Е.В. Кудрявцевой, где Acm - ацетоамидометильная защитная группа, прикрывающая SH-группу цистеина, защищая ее от окисления и димеризации по сере.

Результаты исследования влияния синтетического пептида LDSYQCT структурного фрагмента альфа-фетопротеина человека на экспрессию активационных антигенов лимфоцитов больных атопической бронхиальной астмой в сопоставлении с этими же параметрами здоровых доноров приведены в таблице.

Сопоставление иммунологических показателей здоровых доноров и больных, лимфоциты которых подвергали процедуре инкубации без добавления пептида (контроль) в целом подтверждает характерные изменения в экспрессии маркеров активации, выявленные ранее у этих больных. Так, при обострении заболевания, увеличено количество клеток экспрессирующих функциональные активационные антигены CD54(ICAM1) и CD23 в 2,5 - 3 раза, что свидетельствует о воспалении сопровождающемся интенсивным антителогенезом. Увеличение экспрессии CD54(ICAM1) интерпретируется как повышение готовности к миграции лимфоцитов и их участие в антигенной презентации. Увеличение экспрессии CD23, низкоаффинного рецептора для IgE, - свидетельство В-клеточной активации.

Количество лимфоцитов, экспрессирующих дифференцировочные активационные антигены CD25, HLA-DR, CD95, а также CD95L у больных увеличено примерно на 50% по сравнению со здоровыми донорами, что свидетельствует о средней тяжести заболевания.

Таблица 1. Активированные формы лимфоцитов при культивировании в присутствии синтетического пептида АФП14-20

Активационные антигены лимфоцитов

Здоровые

доноры

Больные бронхиальной астмой

аминокислотный

контроль

АФП14-20

опыт

CD54(ICAM1)

5,49±0,98%

14,17±1,04%

8,65±0,57%***

CD23

5,26±0,60%

13,11±0,82%

12,45±1,11%

CD25

6,09±0,50%

9,75±0,39%

10,10±0,46%

HLA-DR

11,93±0,55%

17,86±1,51%

10,69±1,24%**

CD95

4,64±0,34%

6,44±0,64%

13,19±0,99%***

CD95L

9,22±1,04%

13,85±1,09%

17,13±1,59

Примечание: *-p<0,05; **-p<0,01; ***-p<0,001; достоверность различий указана для опытной группы по сравнению с контрольной.

Под влиянием АФП14-20 функциональные активационные антигены CD54(ICAM1) и CD23 испытывают разнонаправленные изменения. Так, количество лимфоцитов экспрессирующих CD54(ICAM1), молекулы межклеточной адгезии, достоверно снижается, что свидетельствует о торможении процессов миграции и антигенной презентации и указывает на противовоспалительный характер действия пептида. Однако, при этом, АФП14-20 не влияет на количество лимфоцитов, экспрессирующих рецептор CD23 и, следовательно, не влияет на В-клеточную активацию лимфоцитов.

Под влиянием АФП14-20 количество лимфоцитов, экспрессирующих дифференцировочные активационные антигены CD25, HLA-DR, CD95, а также CD95L изменяется в неодинаковой степени. Так пептид АФП14-20 не влияет на количество лимфоцитов, экспрессирующих ранний активационный антиген CD25 - рецептор к интерлейкину 2, что свидетельствует о его неспособности к торможению иммунной активации. Вместе с тем количество лимфоцитов, несущих поздний активационный антиген - рецептор HLA-DR под влиянием пептида существенно понижается практически до уровня здоровых доноров. А количество лимфоцитов несущих рецептор запуска активационного апоптоза - CD95 увеличивается более чем вдвое. При этом содержание лимфоцитов, экспрессирующих лиганд для рецептора CD95 - CD95L, имеет тенденцию к увеличению.

Влияние пептида АФП14-20 на лимфоциты, активированные воспалительным процессом у больных атопической бронхиальной астмой, наиболее выражено для двух поверхностных рецепторов - HLA-DR и CD95. Отношение HLA-DR/CD95 показывает насколько зрелые клеточные формы лимфоцитов преобладают над лимфоцитами, готовыми к вступлению на путь активационного апоптоза. Величина этого показателя, определённая у больных составляет 3,07±0,44, под влиянием пептида достоверно понижается до 0,86±0,12 p<0,001. Полученные результаты свидетельствуют о том, что готовность лимфоцитов, активированных воспалительным процессом к апоптозу под влиянием пептида АФП14-20, в целом, увеличивается, однако из этих данных неясно, насколько эта готовность реализуется. Ответ на этот вопрос был получен в следующих экспериментах.

Изучение апоптоза, развивающегося в CD95+-лимфоцитах, показало, что уровень апоптоза в CD95+-лимфоцитах больных составляет 31,51±3,16%. Под влиянием пептида количество лимфоцитов, несущих рецептор CD95 (CD95+-клетки) и находящихся в состоянии апоптоза, увеличивается до 64,30±5,66%, p<0,001. При этом количество CD95 позитивных лимфоцитов находящихся в состоянии апоптоза у здоровых доноров не менее 80%.

Заключение. Таким образом, исследуемый пептид АФП14-20 влияет на активационный процесс в лимфоцитах путем увеличения экспрессии рецептора запуска активационного апоптоза CD95, повышает апоптоз среди CD95+-лимфоцитах, что ведет к снижению количества зрелых HLA-DR+-клеток. В то же время, указанный пептид не предотвращает раннюю активацию лимфоцитов и не влияет на В-клеточную активацию и экспрессию рецептора, являющегося лигандом для CD95, т.е. CD95L. Молекулярный механизм действия усиления апоптоза лимфоцитов под влиянием пептида АФП14-20 может быть объяснен либо активацией внутриклеточных тирозинкиназ, вызывающих синтез рецептора CD95, либо действием пептида на уровне плазматической мембраны, вызывающим тримеризацию уже синтезированных субъединиц рецептора CD95.


Библиографическая ссылка

Терентьев А.А., Порядин Г.В., Салмаси Ж.М., Александрова И.А., Тагирова А.К., Молдогазиева Н.Т., Казимирский А.Н. УСИЛЕНИЕ АПОПТОЗА CD95+-ЛИМФОЦИТОВ ПОД ВЛИЯНИЕМ СИНТЕТИЧЕСКОГО ПЕПТИДА ИЗ АЛЬФА-ФЕТОПРОТЕИНА ЧЕЛОВЕКА (АФП14-20) // Современные наукоемкие технологии. – 2005. – № 10. – С. 66-68;
URL: https://top-technologies.ru/ru/article/view?id=23669 (дата обращения: 24.09.2021).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074