Научный журнал
Современные наукоемкие технологии
ISSN 1812-7320
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,940

ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ТЕМПЕРАТУРЫ НА СИНТЕЗ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ ПРОДУЦЕНТОМ МEDUSOMYCES GISEVII

Гладышева Е.К. 1
1 ФГБУН «Институт проблем химико-энергетических технологий Сибирского отделения Российской академии наук»
Исследован биосинтез бактериальной целлюлозы на синтетической глюкозной среде с использованием симбиотической культуры Мedusomyces gisevii в интервале температур от 21 до 36?°С. Установлено, что для синтеза бактериальной целлюлозы культурой Мedusomyces gisevii оптимальным является температурный диапазон от 24 до 27?°С, отклонения от оптимума вызывают снижение целлюлозосинтетической способности. Отмечено, что температурные оптимумы для жизнедеятельности Мedusomyces gisevii и для биосинтеза бактериальной целлюлозы не совпадают, повышение температуры культивирования приводит к интенсификации синтеза органических кислот, при этом снижается выход бактериальной целлюлозы. Установлено, что степень полимеризации бактериальной целлюлозы снижается обратно пропорционально повышению температуры культивирования. Показано, что инфракрасные спектры образцов бактериальной целлюлозы, полученных в исследуемом диапазоне температур, идентичны.
бактериальная целлюлоза
температура
Мedusomyces gisevii
степень полимеризации
инфракрасная спектроскопия
1. Алешина Л.А., Глазкова С.В., Луговская Л.А., Подойникова М.В., Фофанов А.Д., Силина Е.В. Современные представления о строении целлюлоз (обзор) // Химия растительного сырья. – 2001. – № 1. – С. 5–35.
2. Гладышева Е.К., Скиба Е.А. Биосинтез бактериальной целлюлозы культурой Мedusomyces gisevii // Вестник ВГУИТ. – 2015. – № 3. – С. 149–156.
3. Добрыня Ю.М., Бондарева Н.И., Аванесян С.С., Тимченко Л.Д., Симечёва Е.И., Ржепаковский И.В. Влияние озонирования на содержание этилового спирта в культуральной жидкости Medusomyces gisevii (чайный гриб) при разных температурных режимах культивирования // Фундаментальные исследования. – 2015. – № 7–3. – С. 454–457.
4. Кезина Е.В., Парчайкина О.В., Кадималиев Д.А., Ревин В.В., Котина Е.А. Получение карбоксиметильных производных бактериальной целлюлозы с высокой степенью замещения // Актуальная биотехнология. – 2014. – № 3. – С. 37.
5. Петухова Н.И., Колобова С.А., Назмутдинова Р.Р., Зорин В.В. Синтез целлюлозы изолятами уксуснокислых бактерий из «Чайного гриба» // Башкирский химический журнал. – 2016. – Т. 33, № 1. – C. 7–13.
6. Смирнова Е.Г. Повышение устойчивости бумаги к старению формированием ее композиционного состава: дис…докт. тех. наук: 05.21.03 / Смирнова Екатерина Григорьевна. – Санкт-Петербург, 2014. – 32 с.
7. Федорова Р.А., Головинская О.В. О возможности использования Medusomyces gisevii при производстве пшеничного хлеба // Известия Санкт-Петербурского государственного аграрного университета. – 2010. – № 19. – С. 60-64.
8. Юркевич Д.И., Кутышенко В.П. Медузомицет (Чайный гриб): научная история, состав, особенности физиологии и метаболизма // Биофизика. – 2002. – № 6. – С. 1116–1129.
9. Goh W.N., Rosma A., Kaur B., Fazilah A., Karim A.A., Rajeev B. Fermentation of black tea broth (Kombucha): I. Effects of sucrose concentration and fermentation time on the yield of microbial cellulose // International Food Research Journal. – 2012. – № 19 (1). – P. 109–117.
10. Hirai A., Tsuji M. and Horii F. Culture conditions producing structure entities composed of Cellulose I and II in bacterial cellulose // Cellulose. – 1997. – № 4. – P. 239–245.
11. Koon-Yang Lee, Gizem Buldum, Anthanasios Mantalaris, Alexander Bismarck. More than Meets the Eye in Bacterial Cellulose: Boisynthesis, Bioprocessing, and Applications in Advanced Fiber Composites // Macromolecular Bioscience. – 2014. – № 6. – P. 10–32.
12. Paavo A. Penttila, Junji Sugiyma, Tomoya Imai. Effects of reaction conditions on cellulose structures synthesized in vitro by bacterial cellulose synthases // Carbohydrate Polymers. – 2016. – № 136. – P. 656–666.
13. Son H.J., Heo M.S., Kim Y.G., Lee S.J. Optimization of fermentation conditions for the production of bacterial cellulose by a newly isolated Acetobacter // Biotechnology and Applied Biochemistry. – 2001. – Vol. 33, № 1. – P. 1–5.
14. Xueqiong Yin, Changjiang Yu, Xiaoli Zhang, Jianxin Yang, Qiang Lin, Jinbang Wang, Qingmei Zhu. Comparison of succinylation methods for bacterial cellulose and adsorption capacities of bacterial cellulose derivatives for Cu2+ ion // Polymer Bulletin. – 2011. – № 67. – P. 401–412.

В настоящее время не только за рубежом [11], но и в России широко ведутся исследования свойств, получения и применения бактериальной целлюлозы (БЦ). На основе бактериальной целлюлозы получены карбоксиметильные производные с высокой степенью замещения [4]. Выделены новые эффективные целлюлозосинтезирующие штаммы [5]. Исследовано применение БЦ в целлюлозно-бумажной промышленности [6].

Процесс получения БЦ длительный и сложный, при этом выход целлюлозы низкий, что обусловлено биохимизмом процесса – для микроорганизмов-продуцентов синтез БЦ не является целевым. Изучение влияния различных условий культивирования продуцента на синтез БЦ проводится с целью повышения ее выхода. Основные параметры, влияющие на рост целлюлозосинтезирующих бактерий и образование БЦ – аэрация, температура культивирования, концентрация источника углерода, состав питательной среды, солнечный свет. Реакция микроорганизмов на эти факторы объясняется явлениями индукции и репрессии синтеза ферментов, в результате которых изменяется морфология клеток и их биосинтетическая способность [11].

Для каждого продуцента и конкретного штамма необходимо уточнять технологические параметры, основным из них является температура. Изучение влияния температуры на синтез БЦ продуцентом Acetobacter sp.A9 на среде Хестрима – Шреммана приведено в работе [13]. Для данного штамма оптимальной температурой для синтеза БЦ является 30 °С, снижение температуры культивирования до 25 °С несущественно снижает выход БЦ по сравнению с 30 °С, однако увеличение температуры культивирования до 35 °С значительно снижает выход БЦ. Температура культивирования влияет не только на выход, но и на физико-химические свойства БЦ, а именно строение и кристаллическую структуру. Установлено, что в образцах БЦ, синтезированных штаммом Acetobacter xylinum ATCC 23769, при температуре 4 °C преобладает триклинная модификация Ιβ [10], характерная для растительной целлюлозы [1]. При культивировании данного штамма при температуре 28 °C в образцах преобладает низкосимметричная метастабильная фаза Iα. Исследовано влияние температуры на выход БЦ, полученной с использованием продуцента Komagataebacter xylinum ATCC 53524 [12], и степень полимеризации полученных образцов БЦ. Структура полученных образцов БЦ исследована методом инфракрасной спектроскопии. Установлено, что для данного штамма оптимальной температурой для синтеза БЦ является 33 °С, температура не влияет на степень полимеризации полученных образцов БЦ, при культивировании при более высоких температурах в образцах БЦ преобладает триклинная модификация.

Ранее детально изучалось влияние температуры на рост и жизнедеятельность симбиотической культуры Мedusomyces gisevii [8]. Продуцент Мedusomyces gisevii представляет собой симбиотическую культуру, состоящую из 20–26 видов дрожжей и 8–10 уксуснокислых бактерий. Мedusomyces gisevii может использоваться как для синтеза БЦ [9], так и для получения освежающего, слегка газированного напитка [7]. Установлено, что оптимальной является температура в диапазоне 25–30 °С. В настоящее время изучено влияние озонирования на содержание этилового спирта в культуральной жидкости Мedusomyces gisevii при разных температурных режимах культивирования [3]. В данной работе не выявлено существенного влияния озона на количественные показатели этилового спирта, однако установлено, что при повышении температурных режимов его концентрация в питательной среде значительно снижается.

Целью данной работы является изучение влияния температуры на синтез БЦ продуцентом Мedusomyces gisevii и исследование структуры полученных образцов.

Материалы и методы исследования

В качестве инокулята использовалась семидневная культура, выращенная на синтетической глюкозной среде, доза внесения составляла 10 %. В экспериментах также использовалась синтетическая питательная среда, приготовленная растворением глюкозы в экстракте черного чая. Начальная концентрация субстрата составила 20 г/л, уровень активной кислотности саморегулировался симбиозом [2]. Культивирование проводилось в статических условиях при температурах от 21 до 36 °С с шагом 3 °С в течение 24 суток. Снижение концентрации глюкозы контролировалось спектрофотометрически (спектрофотометр «UNICOUV-2804», США) с использованием динитросалицилового реактива, уровень активной кислотности контролировался с помощью иономера (иономер И-160 МИ), прирост пленки БЦ оценивался гравиметрически (весы лабораторные аналитические Explorer EX-224).

Образцы пленок были очищены с помощью посуточного выдерживания в разбавленных растворах гидроксида натрия и соляной кислоты с последующим промыванием в дистиллированной воде до нейтральной реакции среды. Прозрачные гель-плёнки, высушивались на воздухе при комнатной температуре в расправленном состоянии.

В полученных образцах определена степень полимеризации по стандартной методике, которая основана на определении времени истечения из капиллярного вискозиметра разбавленных растворов целлюлозы и растворителя (кадоксена). Структура бактериальной целлюлозы была исследована на инфракрасном спектрофотометре «Инфралюм ФТ-801» в таблетках KBr.

Результаты исследования и их обсуждение

На рис. 1 представлена зависимость выхода БЦ от различных температурных режимов культивирования, на рис. 2 – зависимость выхода БЦ от температуры на 16-е сутки культивирования.

glad1.wmf

Рис. 1. Зависимость выхода БЦ от температуры культивирования

glad2.wmf

Рис. 2. Зависимость выхода БЦ от температуры на 16-е сутки культивирования

Рост гель-пленок БЦ происходит до 16 суток, далее наблюдается стационарная фаза и после 20-х суток – деградация БЦ. Температура от 24 до 27 °С наиболее благоприятна для синтеза БЦ, так как обеспечивает наибольший выход – 9 %. При температуре 30 °C и выше отмечается значительное снижение выхода БЦ: например при 36 °С выход составляет 1,5 %, что в 6 раз ниже, чем при 27 °С. Вероятно, при температуре выше 30 °C начинают происходить конформационные изменения ферментов, входящих в целлюлозосинтезирующий энзимный комплекс. Температура ниже 24 °С является недостаточной, так при 21 °С выход БЦ снижается и составляет 6,5 %, это явление может быть объяснено правилом Вант-Гоффа: при изменении температуры на каждые 10 градусов скорость большинства реакций изменяется в 2–4 раза.

В табл. 1 представлены данные по изменению концентрации редуцирующих веществ в процессе культивирования Мedusomyces gisevii при разных температурах.

Таблица 1

Снижение концентрации редуцирующих веществ при культивировании Мedusomyces gisevii

Температура, °С

Продолжительность, сутки

0

1

2

3

6

7

10

13

15

17

20

24

21

20,0

20,0

16,2

12,8

4,9

3,8

1,7

1,7

1,7

1,7

1,7

1,7

24

20,0

20,0

16,4

12,0

3,2

2,2

1,0

1,0

1,0

1,0

1,0

1,0

27

20,0

20,0

15,4

10,0

3,2

1,8

1,5

1,5

1,5

1,5

1,5

1,5

30

20,0

18,9

12,2

8,4

3,1

2,1

1,4

1,4

1,4

1,4

1,4

1,4

33

20,0

19,8

12,0

6,0

3,1

2,0

1,1

1,1

1,1

1,1

1,1

1,1

36

20,0

18,8

13,1

3,0

1,5

1,3

1,3

1,3

1,3

1,3

1,3

1,3

В исследованном диапазоне температур скорость убыли редуцирующих веществ при культивировании Мedusomyces gisevii тем больше, чем выше температура, т.е. температурные оптимумы для утилизации субстрата и для синтеза БЦ не совпадают.

На рис. 3 представлено изменение уровня активной кислотности при культивировании Мedusomyces gisevii при разных температурах.

glad3.wmf

Рис. 3. Изменение уровня активной кислотности при культивировании Мedusomyces gisevii

Повышение температуры от 21 до 36 °С при культивировании симбиотической культуры Мedusomyces gisevii приводит к снижению уровня активной кислотности в обратно пропорциональной зависимости. Снижение уровня активной кислотности свидетельствует об образовании таких метаболитов, как уксусная, янтарная, глюконовая, молочная и яблочная кислоты [8]. Концентрация кислот возрастает прямо пропорционально повышению температуры культивирования в исследуемом диапазоне. Это не противоречит повышению скорости утилизации субстрата, таким образом, при повышении температуры выше 30 °С снижение выхода БЦ объяснено расходованием субстрата на биосинтез кислот.

Степень полимеризации образцов БЦ, синтезированных при различных температурах, на 10-е сутки культивирования, представлена в табл. 2.

Таблица 2

Степень полимеризации образцов бактериальной целлюлозы, синтезированных при различных температурах

Температура, °С

21

24

27

30

33

36

Степень полимеризации

2470

2880

2600

2200

2000

1390

Наибольшую степень полимеризации имеет образец, синтезированный при температуре 24 °C. При температурах выше 24 °С степень полимеризации снижается. Обнаруженная зависимость имеет нелинейный характер и сопоставима с зависимостью выхода БЦ от температуры. Таким образом, установлено, что условия культивирования влияют на свойства конечного продукта. Полученные данные раскрывают возможность контролировать процесс биосинтеза БЦ и получать материал с заданными свойствами.

Методом инфракрасной спектроскопии была установлена структура бактериальной целлюлозы. Сравнение полос поглощения функциональных групп в образцах бактериальной целлюлозы, полученных при различных температурах на 10-е сутки культивирования, представлено в табл. 3.

Таблица 3

Отнесение полос поглощения функциональных групп в образцах бактериальной целлюлозы

Отнесение полос поглощения*

Максимум полосы поглощения, см-1

21 °С

24 °С

27 °С

30 °С

33 °С

36 °С

OH-групп, участвующих в межмолекулярных и внутримолекулярных H-связях

3426

3424

3429

3419

3423

3354

связей в группах CH и CH2

2919

2918

2920

2854

2896

2896

2897

связей HOH обусловлено присутствием прочно связанной воды

1654

1654

1654

1638

1654

1540

1639

1541

1631

групп CH2

1430

1373

1430

1373

1430

1375

1429

1372

1429

1372

1429

1371

групп OH в CH2OH

1320

1337

1318

1337

1318

1337

1318

групп CH2 в CH2OH

1282

1235

1282

1235

1282

1235

1281

1235

1281

1235

1281

1235

групп OH

1201

1205

1204

1204

связей C-O (характерные для полисахаридов полосы, обусловленные наличием ацетильных связей C-O-C и связей С-О в спиртах)

1060

1165

1059

1165

1060

1166

1113

1058

1166

1059

1164

1112

1060

-1,4 связи

898

898

899

899

898

898

* – валентные колебания, – деформационные колебания, БЦ – бактериальная целлюлоза

Интенсивная полоса 3200–3600 см-1 обусловлена валентными колебаниями OH-групп. Менее интенсивная полоса в области 2800–3000 см-1 обусловлена валентными колебаниями групп CH2, CH. Ряд полос различной интенсивности в диапазоне 2000–1500 см-1 – чувствителен к химическим и структурным превращениям. Полосы поглощения в области 1000–1200 см-1 обусловлены в основном валентными колебаниями C-O-C и C-O в спиртах. Полоса при 899 см-1 подтверждает наличие β-1,4 связей [14]. Спектральные характеристики образцов БЦ, синтезированных в исследуемом диапазоне температур, идентичны.

Выводы

Исследован биосинтез БЦ на синтетической глюкозной среде с использованием симбиотической культуры Мedusomyces gisevii в интервале температур от 21 до 36 °С. Установлено, что для синтеза БЦ культурой Мedusomyces gisevii оптимальным является температурный диапазон от 24 до 27 °С, отклонения от оптимума вызывают снижение целлюлозосинтетической способности. Отмечено, что температурные оптимумы для жизнедеятельности Мedusomyces gisevii и для биосинтеза БЦ не совпадают, повышение температуры культивирования приводит к интенсификации синтеза органических кислот. Установлено, степень полимеризации БЦ снижается обратно пропорционально повышению температуры культивирования. Показано, что инфракрасные спектры образцов БЦ, полученных в исследуемом диапазоне температур, идентичны.


Библиографическая ссылка

Гладышева Е.К. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ТЕМПЕРАТУРЫ НА СИНТЕЗ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ ПРОДУЦЕНТОМ МEDUSOMYCES GISEVII // Современные наукоемкие технологии. – 2016. – № 8-1. – С. 36-40;
URL: https://top-technologies.ru/ru/article/view?id=36098 (дата обращения: 22.05.2024).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1,674