Scientific journal

Modern high technologies

ISSN 1812-7320

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 0,940

В настоящее время не только за рубежом [11], но и в России широко ведутся исследования свойств, получения и применения бактериальной целлюлозы (БЦ). На основе бактериальной целлюлозы получены карбоксиметильные производные с высокой степенью замещения [4]. Выделены новые эффективные целлюлозосинтезирующие штаммы [5]. Исследовано применение БЦ в целлюлозно-бумажной промышленности [6].

Процесс получения БЦ длительный и сложный, при этом выход целлюлозы низкий, что обусловлено биохимизмом процесса – для микроорганизмов-продуцентов синтез БЦ не является целевым. Изучение влияния различных условий культивирования продуцента на синтез БЦ проводится с целью повышения ее выхода. Основные параметры, влияющие на рост целлюлозосинтезирующих бактерий и образование БЦ – аэрация, температура культивирования, концентрация источника углерода, состав питательной среды, солнечный свет. Реакция микроорганизмов на эти факторы объясняется явлениями индукции и репрессии синтеза ферментов, в результате которых изменяется морфология клеток и их биосинтетическая способность [11].

Для каждого продуцента и конкретного штамма необходимо уточнять технологические параметры, основным из них является температура. Изучение влияния температуры на синтез БЦ продуцентом Acetobacter sp.A9 на среде Хестрима – Шреммана приведено в работе [13]. Для данного штамма оптимальной температурой для синтеза БЦ является 30 °С, снижение температуры культивирования до 25 °С несущественно снижает выход БЦ по сравнению с 30 °С, однако увеличение температуры культивирования до 35 °С значительно снижает выход БЦ. Температура культивирования влияет не только на выход, но и на физико-химические свойства БЦ, а именно строение и кристаллическую структуру. Установлено, что в образцах БЦ, синтезированных штаммом Acetobacter xylinum ATCC 23769, при температуре 4 °C преобладает триклинная модификация Ιβ [10], характерная для растительной целлюлозы [1]. При культивировании данного штамма при температуре 28 °C в образцах преобладает низкосимметричная метастабильная фаза Iα. Исследовано влияние температуры на выход БЦ, полученной с использованием продуцента Komagataebacter xylinum ATCC 53524 [12], и степень полимеризации полученных образцов БЦ. Структура полученных образцов БЦ исследована методом инфракрасной спектроскопии. Установлено, что для данного штамма оптимальной температурой для синтеза БЦ является 33 °С, температура не влияет на степень полимеризации полученных образцов БЦ, при культивировании при более высоких температурах в образцах БЦ преобладает триклинная модификация.

Ранее детально изучалось влияние температуры на рост и жизнедеятельность симбиотической культуры Мedusomyces gisevii [8]. Продуцент Мedusomyces gisevii представляет собой симбиотическую культуру, состоящую из 20–26 видов дрожжей и 8–10 уксуснокислых бактерий. Мedusomyces gisevii может использоваться как для синтеза БЦ [9], так и для получения освежающего, слегка газированного напитка [7]. Установлено, что оптимальной является температура в диапазоне 25–30 °С. В настоящее время изучено влияние озонирования на содержание этилового спирта в культуральной жидкости Мedusomyces gisevii при разных температурных режимах культивирования [3]. В данной работе не выявлено существенного влияния озона на количественные показатели этилового спирта, однако установлено, что при повышении температурных режимов его концентрация в питательной среде значительно снижается.

Целью данной работы является изучение влияния температуры на синтез БЦ продуцентом Мedusomyces gisevii и исследование структуры полученных образцов.

Материалы и методы исследования

В качестве инокулята использовалась семидневная культура, выращенная на синтетической глюкозной среде, доза внесения составляла 10 %. В экспериментах также использовалась синтетическая питательная среда, приготовленная растворением глюкозы в экстракте черного чая. Начальная концентрация субстрата составила 20 г/л, уровень активной кислотности саморегулировался симбиозом [2]. Культивирование проводилось в статических условиях при температурах от 21 до 36 °С с шагом 3 °С в течение 24 суток. Снижение концентрации глюкозы контролировалось спектрофотометрически (спектрофотометр «UNICOUV-2804», США) с использованием динитросалицилового реактива, уровень активной кислотности контролировался с помощью иономера (иономер И-160 МИ), прирост пленки БЦ оценивался гравиметрически (весы лабораторные аналитические Explorer EX-224).

Образцы пленок были очищены с помощью посуточного выдерживания в разбавленных растворах гидроксида натрия и соляной кислоты с последующим промыванием в дистиллированной воде до нейтральной реакции среды. Прозрачные гель-плёнки, высушивались на воздухе при комнатной температуре в расправленном состоянии.

В полученных образцах определена степень полимеризации по стандартной методике, которая основана на определении времени истечения из капиллярного вискозиметра разбавленных растворов целлюлозы и растворителя (кадоксена). Структура бактериальной целлюлозы была исследована на инфракрасном спектрофотометре «Инфралюм ФТ-801» в таблетках KBr.

Результаты исследования и их обсуждение

На рис. 1 представлена зависимость выхода БЦ от различных температурных режимов культивирования, на рис. 2 – зависимость выхода БЦ от температуры на 16-е сутки культивирования.

Рис. 1. Зависимость выхода БЦ от температуры культивирования

Рис. 2. Зависимость выхода БЦ от температуры на 16-е сутки культивирования

Рост гель-пленок БЦ происходит до 16 суток, далее наблюдается стационарная фаза и после 20-х суток – деградация БЦ. Температура от 24 до 27 °С наиболее благоприятна для синтеза БЦ, так как обеспечивает наибольший выход – 9 %. При температуре 30 °C и выше отмечается значительное снижение выхода БЦ: например при 36 °С выход составляет 1,5 %, что в 6 раз ниже, чем при 27 °С. Вероятно, при температуре выше 30 °C начинают происходить конформационные изменения ферментов, входящих в целлюлозосинтезирующий энзимный комплекс. Температура ниже 24 °С является недостаточной, так при 21 °С выход БЦ снижается и составляет 6,5 %, это явление может быть объяснено правилом Вант-Гоффа: при изменении температуры на каждые 10 градусов скорость большинства реакций изменяется в 2–4 раза.

В табл. 1 представлены данные по изменению концентрации редуцирующих веществ в процессе культивирования Мedusomyces gisevii при разных температурах.

Таблица 1

Снижение концентрации редуцирующих веществ при культивировании Мedusomyces gisevii

В исследованном диапазоне температур скорость убыли редуцирующих веществ при культивировании Мedusomyces gisevii тем больше, чем выше температура, т.е. температурные оптимумы для утилизации субстрата и для синтеза БЦ не совпадают.

На рис. 3 представлено изменение уровня активной кислотности при культивировании Мedusomyces gisevii при разных температурах.

Рис. 3. Изменение уровня активной кислотности при культивировании Мedusomyces gisevii

Повышение температуры от 21 до 36 °С при культивировании симбиотической культуры Мedusomyces gisevii приводит к снижению уровня активной кислотности в обратно пропорциональной зависимости. Снижение уровня активной кислотности свидетельствует об образовании таких метаболитов, как уксусная, янтарная, глюконовая, молочная и яблочная кислоты [8]. Концентрация кислот возрастает прямо пропорционально повышению температуры культивирования в исследуемом диапазоне. Это не противоречит повышению скорости утилизации субстрата, таким образом, при повышении температуры выше 30 °С снижение выхода БЦ объяснено расходованием субстрата на биосинтез кислот.

Степень полимеризации образцов БЦ, синтезированных при различных температурах, на 10-е сутки культивирования, представлена в табл. 2.

Таблица 2

Степень полимеризации образцов бактериальной целлюлозы, синтезированных при различных температурах

Наибольшую степень полимеризации имеет образец, синтезированный при температуре 24 °C. При температурах выше 24 °С степень полимеризации снижается. Обнаруженная зависимость имеет нелинейный характер и сопоставима с зависимостью выхода БЦ от температуры. Таким образом, установлено, что условия культивирования влияют на свойства конечного продукта. Полученные данные раскрывают возможность контролировать процесс биосинтеза БЦ и получать материал с заданными свойствами.

Методом инфракрасной спектроскопии была установлена структура бактериальной целлюлозы. Сравнение полос поглощения функциональных групп в образцах бактериальной целлюлозы, полученных при различных температурах на 10-е сутки культивирования, представлено в табл. 3.

Таблица 3

Отнесение полос поглощения функциональных групп в образцах бактериальной целлюлозы

Интенсивная полоса 3200–3600 см-1 обусловлена валентными колебаниями OH-групп. Менее интенсивная полоса в области 2800–3000 см-1 обусловлена валентными колебаниями групп CH2, CH. Ряд полос различной интенсивности в диапазоне 2000–1500 см-1 – чувствителен к химическим и структурным превращениям. Полосы поглощения в области 1000–1200 см-1 обусловлены в основном валентными колебаниями C-O-C и C-O в спиртах. Полоса при 899 см-1 подтверждает наличие β-1,4 связей [14]. Спектральные характеристики образцов БЦ, синтезированных в исследуемом диапазоне температур, идентичны.

Выводы

Исследован биосинтез БЦ на синтетической глюкозной среде с использованием симбиотической культуры Мedusomyces gisevii в интервале температур от 21 до 36 °С. Установлено, что для синтеза БЦ культурой Мedusomyces gisevii оптимальным является температурный диапазон от 24 до 27 °С, отклонения от оптимума вызывают снижение целлюлозосинтетической способности. Отмечено, что температурные оптимумы для жизнедеятельности Мedusomyces gisevii и для биосинтеза БЦ не совпадают, повышение температуры культивирования приводит к интенсификации синтеза органических кислот. Установлено, степень полимеризации БЦ снижается обратно пропорционально повышению температуры культивирования. Показано, что инфракрасные спектры образцов БЦ, полученных в исследуемом диапазоне температур, идентичны.