Scientific journal

Modern high technologies

ISSN 1812-7320

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 0,940

Питание, как процесс употребления пищи удовлетворяет самую насущную потребность человека, выступает необходимым условием существования людей, их общественной и трудовой деятельности. Общественное питание в своих коллективно организованных формах является важнейшим фактором и механизмом реализации социальной политики [7].

Целью работы являлось адаптировать спектрофотометрический метод для количественного определения α-аминокислот в зерновом сырье на основе исследования спектральных характеристик продуктов нингидроновой реакции.

Исходя из цели, были сформулированы следующие задачи:

– адаптировать метод спектрофотометрии и изучить спектральные характеристики в видимой и УФ-области оптической плотности водных растворов экстрактов зернового сырья;

– определить количественный состав заменимых и незаменимых аминокислот с применением 0,2 % раствора нингидрина;

– оптимизировать условия проведения кислотного гидролиза экстрактов образцов с целью повышения выхода суммы α-аминокислот из зернового сырья;

– изучить влияние продолжительности гидролиза на выход суммы α-аминокислот;

– изучить влияние балластных веществ на содержание суммы α-аминокислот в зерновом сырье после гидролиза (в оптимизированных условиях).

На начальном этапе эксперимента проводились исследования спектральных характеристик продуктов реакции α-аминокислот с 0,2 % раствором нингидрина в воде.

В качестве исследуемых образцов было подобрано зерновое сырье, выращенное в различных районах Республики Татарстан. Данные исследования проводились с целью выявления наиболее ценного зернового сырья в зависимости от географического места расположения, климатических условияй и метеорологических особенностей выращивания зерна. Кроме того, выявление генетических особенностей различных сортов зерна и влияние внешних условий при выращивании (одинаковые условия возделывания, дозы и соотношение удобрений, применение различных препаратов, условия, влияющие в значительной степени на биохимический состав). В работе рассмотрено 10 образцов со следующим обозначением: О-1; О-2; О-3; О-4; О-5; О-6; О-7; О-8; О-9 и О-10. Каждый образец отличается внешними признаками, формой, цветом, размером, а также районом выращивания и периодом созревания [8].

Изучение спектральных характеристик проводилось на спектрофотометре ПЭ-5300 ВИ в лаборатории биохимического анализа кафедры ТПП КНИТУ. Зерновое сырье (образцы) подверглось экстрагированию с получением водной эмульсии [1].

В результате исследования водных растворов образцов на спектрофотометре были получены следующие результаты в виде спектров поглощения оптической плотности (рис. 1).

Рис. 1. УФ-область спектра продуктов взаимодействия экстракта зерновых культур с 0,2 % раствором нингидрина в воде: где D – оптическая плотность, λ – длина волны, нм

В результате эксперимента установлено, что для всех исследуемых образцов зерновых культур характерны четыре максимума поглощения, два из которых находятся в УФ-области, в интервале 220–240 и 250–260 нм, и два – в видимой области, в диапазоне 380–400 и 560–580 нм. Данная закономерность наблюдается для всех исследуемых образцов и объясняется наличием первичных аминогрупп α-аминокислот в структуре зернового сырья.

Таким образом, большинство продуктов реакции α-аминокислот с раствором нингидрина в воде характеризуется единым максимумом поглощения при длине волны 400 нм, что обусловливает целесообразность использования данной длины волны в качестве аналитической (табл. 1) [2].

Таблица 1

Характеристика спектров поглощения продуктов реакции α-аминокислот с 0,2 % раствором нингидрина

В работе [5] установлено, что водный раствор нингидрина имеет интенсивное поглощение в диапазоне длин волн 220 до 330 нм, но совершенно не поглощает в диапазоне длин волн 400–600 нм. Поэтому целесообразно проводить спектрофотометрические исследования продуктов реакции с 0,2 % водным раствором нингидрина в видимой области спектра.

Далее в работе было определено количественное содержание аминокислот в исследуемых образцах в соответствие с методикой [8]. Данная реакция впервые была открыта Руманом. Позднее установлено, что нингидрин специфичен к алифатическим или алициклическим первичным аминогруппам. Вторичные, третичные и четвертичные амины, амиды и амино-замещенные ароматические соединения дают слабую реакцию или не дают вовсе. Исключение – пролин, который образует с нингидрином окраску желтого цвета, как считают некоторые исследователи, благодаря раскрытию цикла.

Свободные α-аминокислоты дают сине-фиолетовое окрашивание с нингидрином. На первой стадии реакции α-аминокислот с нингидрином образуются углерода диоксид, альдегид и устойчивое промежуточное соединение 2-аминоиндандион, участвующий в двух параллельных реакциях. В одной из них он реагирует с нингидрином до образования 2-гидроксииндандиона и 2-иминоиндандиона, которые, конденсируясь между собой, формируют дикетогидринденкетогидринамин. Во второй реакции 2-аминоиндандион в кислой среде подвергается гидролизу до аммиака и 2-гидроксииндандиона, последний, взаимодействуя с нингидрином, образует гидриндантин.

Далее, проводились исследования спектральных характеристик образцов с 0,2 % водным раствором нингидрина после нагревания при температуре 100 °С в течение 15 мин. Для этого в исследуемых образцах, после проведения нингидриновой реакции, определяли оптимальные значения их оптических плотностей.

В водном извлечении зернового сырья аминокислоты содержатся как в свободном, так и в связанном состоянии (в составе пептидов и белков). С целью повышения выхода суммы аминокислот из зернового экстракта в работе были оптимизированы условия проведения кислотного гидролиза.

В качестве гидролизующего агента был использован раствор хлороводородной кислоты, обеспечивающий достаточно полное расщепление белков и пептидов водного экстракта до α-аминокислот. Кроме того, получаемые гидролизаты характеризуются высокой стабильностью, уменьшается вероятность их микробной контаминации, что является важным фактором при подготовке образцов к анализу.

На следующем этапе исследования был изучен аминокислотный состав зернового сырья после кислотного гидролиза. Следует отметить, что несмотря на высокий выход α-аминокислот, проведение кислотного гидролиза в данных условиях связано с воздействием повышенного давления на сырье, сложным аппаратурным оформлением процесса, а также со значительными временными затратами при подготовке гидролизата (более 20 ч), что ограничивает использование данной технологии в условиях промышленного производства. На этом основании целью являлось оптимизировать условия кислотного гидролиза для повышения выхода аминокислот из сырья и разработать доступную методику. К 5 г зернового сырья добавляли 35 мл воды и оставляли на 30 мин. Далее к сырью добавляли 65 мл раствора хлороводородной кислоты в концентрации от 0,5 М до 5 М и проводили гидролиз при температуре 80–90 °С в течении 2 ч. Затем гидролизат отделяли фильтрованием, а сырье для его более полного истощения четырехкратно экстрагировали водой (в соотношении 1:6) по 30 мин в аналогичном температурном режиме. Полученные извлечения фильтровали и объединяли с гидролизатом.

К объединенному гидролизату добавляли натрий гидрокарбонат до нейтральной реакции, переносили в мерную колбу вместимостью 250 мл и доводили водой до метки. В результате кислотного гидролиза образуется комплекс балластных веществ (в том числе и продукты частичного гидролиза ВМС), снижающих качество готового продукта. Для очистки от данных веществ, к 25 мл гидролизата добавляли трехкратный объем 96 % этанола и оставляли в течение 10–12 ч при температуре 3–4 °С. Образующийся осадок отделяли центрифугированием, после чего извлечение сгущали до полного удаления этанола, переносили в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводили водой до метки.

Далее проводилась нингидриновая реакция. Установлено, что гидролиз зернового сырья 1 М раствором хлороводородной кислоты обеспечивает наиболее высокий выход суммы аминокислот – до 0,94 % в пересчете на конкретную аминокислоту (рис. 2).

Как видно из рисунков, количественное содержание незаменимых α-аминокислот в образцах незначительно варьируется, наиболее обогащенными можно выделить образцы О-2, О-4, и О-10, в которых количество незаменимых аминокислот на 20–30 % превышает остальные. Образец О-5 характеризуется наименьшими количественными характеристиками по всем незаменимым аминокислотам [3].

Анализ количественного содержания заменимых аминокислот показал следующие результаты: образцы О-1, О-2, О-4 и О-10 характеризуются наибольшим количественным содержанием заменимых аминокислот (8,91 %, 9,623 %, 9,228 % и 9,487 %), а образец О-5 с наименьшим (6,465 %).

Данные результаты позволяют определить наиболее ценные сорта зерна для использования в технологической линии производства отдельных видов сырья и продукции. Наиболее ценные по аминокислотному составу образцы рекомендуется использовать для приготовления продукции диетического и функционального назначения, а менее ценные образцы – на производство кондитерских и макаронных изделий.

В следующей части эксперимента было изучено влияние продолжительности гидролиза на выход суммы аминокислот.

Кислотный гидролиз, 1 М HCl, проводился в интервале времени 1, 3, 6 и 9 часов. Установлено, что наибольший выход суммы аминокислот из зернового сырья наблюдается при продолжительности гидролиза в течение 6 часов. На нейтрализацию полученного извлечения израсходовано 5 г натрия гидрокарбоната [4]. Данные по оптимизации условий проведения кислотного гидролиза зернового сырья приведены в табл. 2.

Таблица 2

Влияние регулируемых факторов кислотного гидролиза на выход суммы α-аминокислот зернового сырья

Таким образом, в работе оптимизированы условия кислотного гидролиза: к 5 г зернового сырья (точная навеска), высушенного до воздушно-сухого состояния, добавляли 35 мл воды дистиллированной и оставляли на 30 мин для набухания. Затем к набухшему сырью добавляли 65 мл 1 М раствора хлороводородной кислоты и проводили гидролиз при температуре 80–90 °С в интервале до 9 часов.

С целью изучения влияния балластных веществ на содержание суммы α-аминокислот в зерновом сырье после гидролиза (в оптимизированных условиях) были приготовлены кислотные гидролизаты без очистки и с очисткой от балластных веществ с последующим проведением нингидриновой реакции. Результаты представлены на примере незаменимой аминокислоты α-валин (рис. 3).

Рис. 3. Содержание незаменимых аминокислот в образцах с центрифугированием и без

По результатам диаграмм (по всем незаменимым аминокислотам) видно, что образцы подвергнувшиеся удалению балластных веществ методом центрифугирования, характеризуются содержанием незаменимых аминокислот на 1,5–2,7 % больше, чем в образцах без удаления балластных веществ. Так как исходное извлечение водного экстракта зернового сырья содержит вещества, реагирующие с нингидрином (а именно пептиды и белки), влияющие на изменение значений оптической плотности, может дать ошибку результат количественного содержания α-аминокислот. Поэтому для получения достоверных результатов, отражающих количественное содержание суммы α-аминокислот в растительном сырье, необходимо проводить доочистку от сопутствующих ВМС с помощью осаждения этанолом. Результаты количественного содержания суммы α-аминокислот в исследуемых образцах представлены в табл. 3.

Таблица 3

Суммарное содержание α-аминокислот в зерновом сырье

Статистическая обработка метода количественного определения суммы α-аминокислот в зерновом сырье характеризуется достаточно высокой точностью определения и воспроизводимостью. Относительная ошибка результатов определения для всех образцов не превышает ± 3 %.

В результате эксперимента были оптимизированы методы определения α-аминокислот в зерновом сырье, определены количественные характеристики незаменимых и заменимых аминокислот, а также определено их общее содержание с целью выявления образцов наиболее подходящих в технологии производства отдельных видов пищевого сырья [5].

Выводы

В работе проведена адаптация и оптимизация спектрофотометрического метода в количественном анализе суммы свободных α-аминокислот зернового сырья. На основе исследования спектральных характеристик продуктов нингидроновой реакции подобраны условия проведения биохимических исследований водных экстрактов образцов:

– исследованы спектральные характеристики продуктов реакции α-аминокислот с 0,2 % раствором нингидрина в видимой и УФ-области излучения;

– установлено, что, спектры поглощения в видимой области характеризуются наличием двух максимумов в диапазонах длин волн 380–400 и 560–580 нм, а также исследована УФ- область спектра поглощения продуктов реакции с 0,2 % раствором нингидрина, где установлено наличие двух максимумов в диапазонах длин волн 220–240 и 250–260 нм;

– определено, что большинство продуктов реакции α-аминокислот с раствором нингидрина в воде характеризуется единым максимумом поглощения при длине волны 400 нм, что обусловливает целесообразность использования данной длины волны в качестве основной аналитической;

– с целью повышения выхода суммы α-аминокислот из зернового экстракта были оптимизированы условия проведения кислотного гидролиза при использовании 1 М раствора хлороводородной кислоты;

– оптимизированные условия проведения кислотного гидролиза повысили выход α-аминокислот из сырья до максимального показателя 94,7 %;

– установлено, что наибольший выход суммы α-аминокислот из зернового сырья наблюдается при продолжительности гидролиза в течение 6 часов;

– определено, что удаление балластных веществ в образцах методом центрифугирования приводит к увеличению точности определения содержания незаменимых аминокислот на 1,5–2,7 %.