Цель исследования. Оценка влияния адопции сингенной цереброспинальной жидкости от крыс с моделью сингенной и аллотрансплантации на трансплантационный иммунитет крыс с аллогенным кожным лоскутом.
Материал и методы исследования. В работе приведены данные, полученные от 32 крыс линии Brown Norway, весом 160-180г. Оперативное вмешательство осуществлялось под гексеналовым наркозом (доза - 70мг./кг., внутрибрюшинно). Трансплантация кожного лоскута и его выживаемость воспроизводилась и оценивалась по общепринятому методу. [1] Адопция цереброспинальной жидкости в III желудочек мозга проводилась раз в сутки согласно стандартной стереотопографии по точке Bregma на аппарате WPI (Germany). [8] Количественное определение показателей иммунного статуса проводили с использованием набора дифференцировочных маркеров (Sandoz Pharma AG, Switzerland). Статистическая обработка результатов проводилась с расчетом критерия Стъюдента, с достоверностью различий при p≤0,05.
Полученные результаты и их обсуждение. В первой серии экспериментов оценивалась реактивность иммунной системы крыс Brown Norway (BN) с аллотрансплантатом от крыс Sprague Dawley (SD), в условиях трансфузии сингенной цереброспинальной жидкости (ЦСЖ) от доноров с сингенным лоскутом. Для сравнения рассматривалась группа крыс той же линии (BN) с аллогенным (SD) лоскутом. (Таблица) Показано, что лишь число лейкоцитов снизилось на 10% в сравнении с показателем в группе сравнения. Тогда как, численность остальных показателей имела тенденцию к снижению.
В следующей (второй) серии экспериментов в качестве опытной группы использовались крысы BN с трансплантатом от крыс SD, в условиях адопции ЦСЖ от сингенных крыс с аллогенным SD лоскутом. Задачей была оценка иммунологической активности сингенной ЦСЖ, адоптированной от доноров с аллогенным (SD) трансплантатом. Показано, что в сравнении с крысами без адопции ЦСЖ, количество лейкоцитов не уменьшалось, а отдельные показатели характеризовались возрастанием, в том числе, количество моноцитов/макрофагов достоверно возросло в сравнении с предыдущей экспериментальной группой. Схожий вектор изменений был характерен для общего пула лимфоцитов и его Т-хелперной составляющей, однако статически достоверного увеличения клеточности не отмечено. Значительное увеличение клеточности имело место среди Т-лимфоцитов CD3+ и NK-клеток, которые достоверно превышали эти же показатели в вышеприведенной группе с адоптированным сингенным ликвором.
Заключительная экспериментальная серия (третья) была призвана продемонстрировать особенности трансплантационной реакции у крыс BN с аллотрансплантатом от крыс SD и с адопцией сингенного ликвора от доноров с лоскутом от беспородных особей. Общее количество лейкоцитов достоверно снизилось по отношению к группе животных без ликворотрансфузии. Количество нейтрофилов, мононуклеаров, общего пула лимфоцитов, хелперной и эффекторной субпопуляций Т-лимфоцитов не имело достоверных отличий от показателей в приведенных выше группах.
Таблица 1. Показатели иммунограммы крыс с аллотрансплантатом в условиях адопции сингенной ЦСЖ от доноров с различной моделью трансплантации
|
показатели иммунитета (×106/L) |
крысы BN с аллогенным кожным лоскутом от крыс SD |
крысы BN с аллотрансплантатом SD + адопция сингенной ЦСЖ от крыс с сингенным лоскутом |
крысы BN с аллотрансплантатом SD + адопция сингенной ЦСЖ от крыс с аллогенным лоскутом SD |
крысы BN с аллотрансплантатом SD + адопция сингенной ЦСЖ от крыс с лоскутом от б/породн. крыс |
|
лейкоциты |
8601,2±168,9 |
7721,4±150,5a |
8057,8±221,3 |
7841,5±256,1a |
|
нейтрофилы |
4148,6±68,1 |
4126,9±84,5 |
4099,9±19,8 |
4135,7±60,4 |
|
мононуклеары |
256,1±5,9 |
239,4±5,3 |
273,3±9,2b |
253,2±4,5 |
|
лимфоциты |
3718,5±102,2 |
3605,4±112,4 |
3837,2±140,6 |
3798,8±106,5 |
|
B-лимфоциты |
450,3±10,5 |
441,6±12,1 |
431,8±4,0 |
472,2±4,9bc |
|
Т-лимфоциты |
3058,8±224,8 |
2852,9±177,9 |
3476,6±157,5b |
2860,4±172,0c |
|
Т-хелперы |
2063,1±102,3 |
1831,8±80,8 |
2091,9±138,3 |
2121,4±111,1 |
|
Т-эффекторы |
983,5±67,4 |
965,8±39,0 |
955,8±50,2 |
987,5±55,3 |
|
NK-клетки |
315,3±12,8 |
296,6±5,8 |
336,5±11,7b |
326,7±5,1b |
Примечания: во всех сравниваемых группах n = 8
a - достоверно по отношению к контрольной группе крыс BN без ликворотрансфузии
b - достоверно по отношению к группе крыс BN с адопцией ЦСЖ от доноров BN с сингенным лоскутом
c - достоверно по отношению к группе крыс BN с адопцией ЦСЖ от доноров BN с аллогенным SD лоскутом
В группе крыс третьей экспериментальной серии число В-лимфоцитов имело тенденцию к увеличению в сравнении с контрольной группой крыс и статистически значимо повышалось в сравнении с двумя предыдущими опытными группами (с адопцией ЦСЖ от доноров с лоскутом BN и от доноров с лоскутом SD). Кроме того, в описываемой группе наблюдается снижение числа Т-лимфоцитов в сравнении с группой животных с ликворотрансфузией от доноров с аллотрансплантатом от линии SD. Число NK-клеток, будучи незначительно ниже, чем в предыдущей группе, все же достоверно отличалось в сторону увеличения в сравнении с первой группой крыс с аллогенным лоскутом и с адопцией сингенной ЦСЖ от крыс с сингенным трансплантатом.
Известно, что иммунограмма позволяет судить об изменениях в иммунной системе лишь во взаимосвязи с другими (более объективными) критериями оценки иммунитета, в силу того, что течение иммунных процессов в организме зависит не столько от количества иммуноцитов в крови, сколько от их функциональной активности, антигенспецифичной вариабельности, цитокинового фона и многих других факторов. [9] В этой связи, приведенная раскладка показателей иммунограммы описанных экспериментальных групп животных представляет интерес лишь при ее анализе во взаимосвязи с особенностями отторжения аллотрансплантата у этих крыс. Так, отторжение лоскута в контрольной группе крыс без каких-либо манипуляций с составом ликвора, омывающего гипоталамическую область ЦНС, носило классический характер и сопровождалось адекватным изменением клеточных показателей иммунитета в периферической крови, свидетельствовавшим об активизации иммунитета, вызванной аллотрансплантацией. В контрольной группе крыс BN срок выживания аллогенного лоскута от линии крыс SD составил 19,0 ± 0,7 суток.
В первой группе крыс линии BN аллогенный лоскут от линии SD подвергся отторжению через 31,9 ± 0,5 суток в условиях адопции сингенной ЦСЖ от доноров линии BN с сингенным лоскутом, т.е. длительность выживания аллотрансплантата достоверно возросла на 13 суток по сравнению с контрольной группой, что, вероятно, обусловлено следующим обстоятельством. Донорский ликвор, по причине сингенности лоскута пересаженного в организм хозяина, не несет в себе активной клеточной и цитокиновой афферентной сигнализации, адресованной иммунокомпетентному микроокружению гипоталамуса и свидетельствующей об интенсивной трансплантационной реакции. Тогда как замещаемый ликвор крыс реципиентов адоптируемого ликвора, включает в свой состав мигрировавшие с периферии лимфоциты и синтезированные вне гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) и непосредственно в ЦНС цитокины и свидетельствует об интенсивной трансплантационной реакции, обусловленной аллогенным лоскутом. Таким образом, адоптированный ликвор, по своему потенциалу иммунотропной активности во многом уступает потенциалу замещаемого ликвора реципиента, следовательно, ликворотрансфузия, в данной ситуации, способствует значительному ослаблению регуляторных импульсов, исходящих из гипоталамического центра поддержания иммунного гомеостаза. Работами ряда исследователей, в определенной мере, подтверждается право на существование представленного суждения. [3] Кроме того, имеет место ослабление регуляции иммунитета за счет травматического (послеоперационного) снижения активности центра поддержания иммунного гомеостаза в гипоталамусе. Привлекает внимание определенной несоответствие между продлением срока жизни аллогенного лоскута и отсутствием статистически значимого отличия иммунограммы описываемой группы от контрольных крыс без адопции ЦСЖ.
Во второй серии экспериментов крысам линии BN с аллогенным лоскутом, полученным от линии SD была адоптирована сингенная ЦСЖ от доноров с такой же моделью трансплантации. Срок выживания аллотрансплантата составил 14,4 ± 0,5 суток, т.е. процессы отторжения усилились и срок выживания лоскута сократился на 4-5 суток. Основываясь на тех же рассуждениях, что и в вышеописанном случае, можно предположить, что трансфузия донорской ЦСЖ, обладающей высокой иммунной активностью, обусловленной трансплантационной реакцией в организме донора, усиливает иммунотропную активность ликвора реципиента, путем повышения числа антигенактивированных иммуноцитов и концентрации цитокинов, входящих в его состав, тем самым, интенсифицируя отторжение за счет центральных механизмов регуляции. В пользу приведенного суждения косвенно свидетельствуют данные, полученные другими исследователями. [7] В то же время, в данной группе корреляция показателей иммунограммы и сроков отторжения лоскута не вполне четкая.
Аллотрансплантат, приживленный животным третьей экспериментальной серии, оставался жизнеспособным в течение 20,8 ± 0,6 дней, что статистически не отличается от срока, наблюдавшегося в контрольной группе крыс, не подвергавшихся адопции ЦСЖ, но достоверно отличается от показателя выживаемости у крыс предыдущей описанной группы почти на 7 дней. Очевидно, что сроки выживания лоскута продлены в сравнении с предыдущей группой вследствие отличия в характеристиках гистосовместимости лоскута крыс описываемой группы от лоскута крыс доноров ликвора, т.е. из-за особенностей антигенспецифичной активации иммунокомпетентной составляющей адоптируемого сингенного ликвора. Логично предположить, что адопция сингенной ЦСЖ от доноров той же линии, но с аллотрансплантатом от беспородных особей оказала цитокинопосредованное активирующее влияние на гипоталамический центр иммунного гомеостаза, но лимфоцитарная составляющая адоптированного ликвора не оказала влияния ввиду различия в антигенной природе беспородного трансплантата у доноров ЦСЖ и линейного (SD) трансплантата у реципиентов ЦСЖ. Более того, по мнению отдельных авторов, не исключено, что лимфоцитарная составляющая адоптируемого ликвора оказывает ингибирующее воздействие на трансплантационную реактивность по причине дезрегуляции МНС-ІІ опосредованной межклеточной кооперации собственных лимфоцитов и нейроглиальных элементов в пределах ГЭБ. [2] Также имеет место супрессия иммунитета вследствие сбоя центральных механизмов регуляции из-за нарушения целостности ГЭБ. [5] Описанный механизм иммунотропного влияния адоптированной ЦСЖ согласуется с приводимыми показателями лимфоцитограммы.
Заключение.
- Адопция сингенной ЦСЖ влияет на интенсивность трансплантационных процессов. Это влияние зависит от иммунных характеристик донорской ЦСЖ, обусловленных иммунными процессами в организме самого донора.
- Интенсивность влияния адоптируемой ЦСЖ на центральную иммунорегуляцию её реципиента зависит от соответствия антигенной специфичности аллографта донора ЦСЖ и аллографта реципиента ЦСЖ.
Работа выполнена при поддержке Научного Комитета НАТО (грант FEL.RIG.980765)
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
- Billingham R. E., Medawar P. //J. Exp. Bio., 1950, 28, P. 385-402.
- Boulanger L.M., Huh G.S., Shatz C.J. //Brain, Behavior, and Immunity. 2003, Vol. 17, Issue 1, Suppl. 1, P. 125-131
- Gordon L.B., Nolan S.C. et al. //J. Neuroimmunol. 1998. №1-2 (88). P.77-84.
- Devi R.S., Namasivayam A. //Indian. J. Physiol. Pharm. 1996. №1 (40). P.70-74.
- Horuzsko A., Lenfant F., Munn D. //International Immunology, 2001, Vol. 13, №3, P. 385-394.
- Katafuchi T., Ichijo T. et al. //J. Physiol. Lond. 1993. (471). P.209-221.
- Nakafusa Y, Goss JA, and Flye MW. //Transplant. Proc. 1993; 25:292-294
- Paxinos G., Watson Ch. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 2 Ed., Academic Press, Sydney, 1986. P. 579
- Petrovsky N. //Immunology and Cell Biology., 2001., Vol. 79, P. 350-357
- Wenner M., Kawamura N. et al. //J. Neuroimmunol. 1996. №1 (67). P.67-70.