Мотивация к употреблению алкоголя на фоне сахарного диабета может иметь несколько оснований: стремление понизить уровень глюкозы крови за счет некоторого гипогликемического действия алкоголя при эпизодическом употреблении, получить антиоксидантное действие, благодаря свойствам самой молекулы этанола, и профилактировать атеросклероз, руководствуясь сведениями о способности алкоголя понижать уровень атерогенного холестерина крови. Однако при употреблении алкоголя на фоне окислительного стресса формируется этанол-зависимая оптимизация биохимических процессов [Фонякова О.Г., 1996; Аксенов А.В., 2004], т.е. появляется тяга к спиртным напиткам, и эпизодическое употребление перерастает в алкогольные запои, что приводит к развитию алкогольной интоксикации.
Цель исследования: оценить основные показатели окислительного стресса в ткани печени и сыворотке крови при алкоголизации в течение семи дней на фоне аллоксанового сахарного диабета.
Материалы и методы
Эксперимент выполнен на 37 самцах белых беспородных крыс. Сахарный диабет моделировали интраперитонеальным введением аллоксана (160мг/кг). Через 2 недели отбирали животных, имевших стойкую гипергликемию выше 11,1 ммоль/л, без кетонурии. Алкогольную интоксикацию вызывали ежедневным интраперитонеальным введением 25% этанола в дозе 2г/кг после кормления на протяжении 7 дней. Животные были разделены на 4 группы: 1 группа - крысы, получавшие инъекци 0,9% раствора NaCl (группа контроля - К, n=9), 2 группа - крысы с алкогольной интоксикацией (А, n=9), 3 группа - животные с сахарным диабетом (СД, n=10), которым также вводился 0,9% раствор NaCl вместо алкоголя, 4 группа - животные с алкогольной интоксикацией на фоне сахарного диабета (СДА, n=9). Через сутки после последнего воздействия животных декапитировали под общим эфирным наркозом. В надмитохондриальной фракции гомогенатов ткани печени исследовали активность антиоксидантных ферментов: глутатионпероксидазы (КФ 1.11.1.9) по методу D.E.Paligia, W.N.Valentine [1967], Cu,Zn-супероксиддисмутазы (КФ 1.15.1.1) [Т.В.Сирота, 1999], каталазы (КФ 1.11.1.6) [М.А.Королюк, 1988], глутатионредуктазы (КФ 1.6.4.2) по методу Racker [1955] с небольшой модификацией, глутатионтрансферазы (КФ 2.5.1.18) по W.H.Habig et al. [1974]; Fe2+ - индуцированную хемилюминесценцию (ХЛ) по Ю.А.Владимирову [1989]. Оценивали светосумму ХЛ за 3 мин (S), латентный период от момента введения ионов железа до начала медленной вспышки (r) и амплитуду быстрой вспышки (h). В цельных гомогенатах ткани печени определяли концентрацию восстановленного глутатиона и количество доступных HS-групп на единицу белка по методу J.Sedlak, R.H.Lindsay [1968]. В сыворотке крови - активность глутатионпероксидазы, общее количество HS-групп на единицу белка и светосумму хемилюминесценции, индуцированной пероксидом водорода за 90 сек [А.К.Журавлев, М.П.Шерстнев, 1985]. Кинетику хемилюминесценции обрабатывали с помощью компьютерной системы Counter-2004. Концентрацию глюкозы в крови определяли глюкозооксидазным и гексокиназным методами, белок в пробах по методу O.H.Lowry et al. [1951]. Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью пакета программ Biostat, SPSS 11.5 и StatSoft Statistica 6.0. Использовали непараметрический критерий Манна-Уитни (U), нормальность распределения исключали по критерию Шапиро-Уилкса.
Результаты исследований и обсуждение
В группе СД на момент проведения исследования (три недели течения диабета) отмечена тенденция к нормализации уровня гликемии крови и компенсации окислительного стресса: несмотря на низкий уровень восстановленного глутатиона (в 2,5 раза по сравнению с контролем), содержание общих HS-групп, активность глутатионпероксидазы (ГПО), глутатионредуктазы (ГР), каталазы ткани печени достоверно не отличалась от группы К, также как и все показатели хемилюминесценции печени; интенсивность хемилюминесценции сыворотки крови была ниже по сравнению с контрольной группой на 35,2% (р=0,009) и , соответственно, более низкая активность глутатионпероксидазы сыворотки - на 32,5% (р=0,028), тогда как содержание общих HS-групп достоверно не отличалось. Возможно, компенсация обусловлена активацией секреции инсулина, что нередко наблюдается при аллоксановом сахарном диабете. На возобновление продукции инсулина указывает и факт достоверного повышения активности супероксиддисмутазы (СОД) ткани печени в 2,2 раза по сравнению с контрольными животными (р<0,001), так как биосинтез и время полужизни этого фермента зависит от инсулин/глюкагонового индекса.
В группе А при семидневной алкоголизации отмечался достоверно более низкий уровень глюкозы по сравнению со всеми группами [Медиана (Ме)=5,81, Х±m=5,46±0,34 ммоль/л]. Однако показатели свободно-радикального окисления в ткани печени укладывались в характерную картину окислительного стресса. По данным хемилюминесценции величина h, показывающая общее содержание гидроперекисей в препарате, была выше контроля в 2,5 раза (р=0,001), показателя S, отражающего количество образовавшихся перекисных радикалов на один ион железа (способность к развитию цепных процессов переокисления) - выше на 56,3% (р<0,001), а показателя r, коррелирующего с антиокислительной активностью исследуемой ткани и зависящего от соотношения про- и антиоксидантов, - была ниже в 2 раза (р<0,001). Причиной повышения содержания гидроперекисей могла стать более высокая, чем у животных контрольной группы активность СОД (на 56,8%, р=0,005), наряду с относительно низкой активностью каталазы, соответствующей группе К. Активность ГПО участвующей, в отличие от каталазы, в утилизации не только перекиси водорода, но и гидроперекисей липидов, повышена на 28,3% (р=0,004), т.е. в печени алкоголизированных крыс активно протекают процессы перекисного окисления липидов и мощность ГПО уже недостаточна, а своевременной адекватной активации каталазы не произошло. ГПО обезвреживает гидроперекиси с участием восстановленного глутатиона (GSH). Концентрация этого трипептида при данном сроке алкоголизации оказалась на 27,9% ниже, чем в печени животных контрольной группы (р<0,001). Активность глутатионредуктазы, пополняющей пул GSH за счет восстановления окисленного глутатиона (GSSG), не изменилась, но увеличилось содержание доступных HS-групп (на 19,4% выше группы К, р=0,034), которые, вероятней всего, являются белковыми. Белковые тиогруппы в неактивном состоянии спрятаны в глубине пространственной структуры или образуют -S-S- связи между отдельными фрагментами белковой молекулы, а также с низкомолекулярными тиолами. Это необходимо для предохранения их от инактивации. Увеличение количества доступных HS-групп, наряду со снижением уровня GSH, свидетельствует о существенной потере не только свободного глутатиона, но и связанного, из комплексов с белками. Кроме того, повышение доступности HS-групп может быть обусловлено развитием ацидоза в ткани печени на фоне введения алкоголя. Свободные радикалы в биологических системах выполняют различные физиологические функции, например, выступая в качестве сигнальных молекул и факторов транскрипции, являясь индукторами синтеза интерлейкинов, что наблюдается, в частности, и при алкогольном поражении печени. Алкогольная интоксикация в течение семи дней способна вызвать токсический гепатит, в результате чего усиливается синтез белков острой фазы воспаления, богатых HS-группами. «Острофазовые» белки поступают из печени в кровь, поддерживая ее антиоксидантную емкость. В нашем случае, мы наблюдали отсутствие достоверных различий с контролем по интенсивности хемилюминесценции и активности ГПО сыворотки крови при значительном в 2,3 раза повышении содержания доступных HS-групп (р=0,001).
В группе СДА достоверной нормализации гликемии не наблюдалось, уровень глюкозы крови был на 47,4% выше, чем у животных группы А (р=0,024). Амплитуда быстрой вспышки ХЛ ниже на 49% (р=0,047), но выше, чем при сахарном диабете без алкогольной интоксикации на 46% (р=0,016). Активность СОД повышена по сравнению с группой К на 66,7% (р<0,001), но относительно ниже, чем в группе СД на 23,9% (р=0,007), с группой А достоверных различий нет. Активность каталазы ниже, чем при алкогольной интоксикации на 12,3% (р=0,027), а повышение активности ГПО печени выражено в меньшей степени. Дискоординация ферментов первой (СОД) и второй (каталаза, ГПО) линий защиты должна логично приводить к увеличению содержания гидроперекисей, чего в данном случае не наблюдается. Известно, что генерация пероксида водорода и метаболизм этанола в целом приводят к закислению среды, индуцируя диссоциацию железа из ферритина, депо которого находится в печени. В присутствии свободных ионов металлов пероксиды подвергаются распаду некаталитическим путем с образованием наиболее активного и опасного гидроксильного радикала ·ОН. Участие ионов металлов переменной валентности в разветвлении цепей перекисного окисления липидов сопровождается увеличением показателя S хемилюминесценции, что и было зафиксировано при исследовании надмитохондриальной жидкости гомогенатов печени в группе СДА: на 77,6% по сравнению с контролем (р<0,001), 53,8% по сравнению с группой СД (р=0,003), 13,7% в отношении А (р=0,038). Сокращение длительности латентного периода в 1,9 раза по сравнению с К (р<0,001) также как в группе А отмечено одновременно со снижением уровня GSH на 36,8% по сравнению с контрольными животными (р<0,001). Тем не менее, содержание GSH в печени крыс, алкоголизированных на фоне сахарного диабета, превышало уровень этого трипептида у крыс группы СД на 56,4% (р=0,009), активность ГР не отличалась, а содержание доступных HS-групп печени было достоверно ниже всех групп сравнения. Такая ситуация возможна при смещении равновесия в сторону низкомолекулярных тиолов из-за окисления или распада высокомолекулярных, что вполне вероятно в результате атаки ОН радикала. Инактивация антиоксидантных и антитоксических ферментов, в активном центре которых играют важную роль HS-группы, приводит к усугублению состояния. Так, уже отмечалась низкая активность каталазы, кроме того, выявлено достоверное снижение активности глутатионтрансферазы: на 32,6% (р=0,001) по сравнению с К, 25,8% (р=0,001) - группой А и 26,2% (р<0,001) - группой СД. В сыворотке крови активность ГПО достоверно не отличалась, содержание доступных HS-групп возросло аналогично животным группы А, но в более выраженной степени (выше контроля в 3,1 раза, р<0,001; выше СД в 3,7 раза, р<0,001; выше А на 35,1%, р=0,005). Вместе с тем, интенсивность хемилюминесценции сыворотки крови была значительно выше всех групп сравнения (по отношению к группам К и А на 35,1%, р=0,005; СД - в 2,1 раза, р=0,002). Такой парадокс вполне объясним, если принять во внимание прогрессирование окислительного стресса в печени: ацидоз и преобладание низкомолекулярных тиолов, а также повреждение высокомолекулярных биологически важных соединений ткани печени ·ОН радикалом и присутствие в достаточном количестве ионов свободных металлов на фоне дефицита инсулина. К белкам острой фазы воспаления, поступающим в кровь, присоединяются низкомолекулярные тиолы, в частности GSH. Кроме того, из поврежденной печени выходят металлы переменной валентности, ацидоз распространяется за рамки пораженного органа. В таких условиях тиолы крови превращаются в тиильные радикалы, становясь прооксидантами. Окислительный стресс приобретает системный характер.
Таким образом, при алкоголизации на фоне аллоксанового сахарного диабета в течение семи дней на первый план выходит нарушение наиболее слабого звена изучаемой патологии - тиол-дисульфидного обмена, т.е. сохраняется и усиливается меркуриальный характер нарушений, прогрессирует окислительный стресс, приобретая системный характер и утяжеляя течение сахарного диабета.