Стресс-реакция оказывает мобилизующий эффект на организм путем увеличения концентрации ионов кальция в мембранах[6]. Кальций является «вторичным мессенджером», передающим внутрь клетки информацию о регуляторных сигналах. Выведение избытка кальция из клетки осуществляется посредством Ca-АТФазы[5,6]. Внутриклеточное кумулирование ионов кальция приводит к увеличению микровязкости липидного матрикса мембран[5,6]. Избыток кальция при затянувшейся стресс-реакции приводит к повреждающему действию на клеточную структуру, что может изменять действие гормонов и медиаторов[6].
Общая стратегия мембранной адаптации заключается в повышении ненасыщенности жирнокислотного состава мембранных фосфолипидов[1,2,3,5]. Однако накопление избыточно окисленных ненасыщенных фосфолипидов может приводить к образованию перекисных кластеров, между которыми образуются каналы ионной проводимости, что ведет к увеличению проницаемости и нарушению свойств мембраны [5]. Стрессовые гормоны прямо или опосредованно активируют липазы, фосфолипазы и увеличивают перекисное окисление липидов (ПОЛ), субстратом которого в мембране являются ненасыщенные жирные кислоты [1,5,6]. В частности, образуются лизофосфолипиды, которые за счет детергентных свойств снижают вязкость и повышают текучесть мембраны, увеличивая тем самым активность мембраносвязанных белков.
Параметры связывания флуоресцентных зондов пирена и АНС с мембраной эритроцита служат хорошим индикатором для оценки молекулярных перестроек в структуре мембраны. Неполярный зонд пирен диффундирует в гидрофобном компартменте мембраны, оценивая микровязкость липидной фазы [5]. Зонд АНС, напротив, обладает отрицательным зарядом и располагается в наиболее функционально активном поверхностном слое, который имеет отношение к рецепторной активности клетки и формированию ионных каналов[5]. Причем отмечено, что увеличение сродства мембраны эритроцита к зонду АНС (повышение анизотропии) сопровождается снижением степени эксимеризации пирена [5]. По данным литературы [5], проявления дизадаптации (в частности психической) способны повышать микровязкость мембран эритроцитов. Возрастание среднего значения анизотропии АНС свидетельствует об увеличении вязкости молекул в поверхностных слоях мембраны, что может негативно отражаться на функционировании мембраносвязанных рецепторов [5].
Целью исследования явилось изучение изменений биофизических свойств мембран эритроцитов у военнослужащих в период прохождения военной службы.
Материалы и методы. В исследовании принимали участие 165 военнослужащих срочной службы (мужчины в возрасте 18-25 лет, практически здоровые) в различные периоды адаптации к условиям службы: 1 группа - прибытие в часть, 2 - 1 месяц, 3 - 6 месяцев, 4 - 12 месяцев, 5 - 18 месяцев, 6 - 24 месяца военной службы. Исследовали суспензию мембран эритроцитов, выделенных из цельной венозной крови по методу J.T. Dodge. Исследование мембран проводили по методу Ю.А.Владимирова и Г.Е. Добрецова (1980) с помощью флуоресцентного зондирования на спектрофлуориметре МРF-4 «Hitachi». Определение текучести глубоких структур липидного бислоя проводили после добавления к 50 мкл суспензии мембран эритроцитов спиртового раствора пирена (5 мкл в концетрации 100 мкмоль/л). Измеряли спектры флуоресценции его эксимеров при длине волны флуоресценции - 400 нм, возбуждения 360 нм. Измерение микровязкости поверхностных слоев проводили по параметрам анизотропии флуоресцентного зонда 1 - анилинонафталин - 8 - сульфоната (АНС), который в концентрации 20 мкмоль/л водного раствора добавляли к 50 мкл суспензии мембран. Степень поляризации флуоресценции характеризовали по величине анизотропии. Возможность связывания мембраной положительно заряженных ионов кальция исследовали с помощью водного раствора флуоресцентного зонда хлортетрациклина (ХТЦ) в концентрации 1 ммоль/л. Результаты выражали в относительных единицах.
Результаты и обсуждение. Нами выявлено, что текучесть глубоких слоев мембран эритроцитов увеличивалась в период острой адаптации к условиям военной службы (табл.1) с 0,474±0,023 отн.ед. (p<0,001) в 1 группе до 0,552±0,02 отн.ед. (p<0,001) во 2 группе. В остальных группах величина этого показателя снижалась (табл.1), причем минимальные значения наблюдались в 5 группе - 0,458±0,024 отн.ед. (p<0,001). Микровязкость поверхностных слоев также увеличивалась в период острой адаптации, причем наименьшие показатели зарегистрированы в 1 группе - 0,54±0,026 отн.ед. (p<0,025), а наибольшие - в 3 (0,71±0,016 отн.ед.,p<0,001). В дальнейшем величина этого показателя уменьшалась (табл.1). Нами рассчитывался (по отношению уровня анизотропии АНС к уровню эксимеризации пирена) показатель коэффициента асимметрии текучести. Он оказался равным единице во 2 группе - 1,089±0,077 отн.ед. (p<0,005), а максимальным - в 5 группе (1,684±0,11 6отн.ед., p<0,001). Эти данные свидетельствуют о значительной модификации структуры мембран у военнослужащих в период острой адаптации (средние показатели текучести и микровязкости относительно равны) и стабилизации биофизических показателей в дальнейшем (табл.1).
Таблица 1. Показатели текучести поверхностных и глубоких слоев мембраны эритроцитов у военнослужащих срочной службы в зависимости от продолжительности службы
|
Группа |
Текучесть*, отн.ед. |
Микровязкость**, отн.ед. |
КАТ***, отн.ед. |
|
1(n=27) |
0,474± 0,0231 |
0,54± 0,0262 |
1,194± 0,0731 |
|
2(n=30) |
0,552± 0,021 |
0,563± 0,00275 |
1,089± 0,0775 |
|
3(n=28) |
0,502± 0,0221 |
0,71± 0,0161 |
1,488± 0,0731 |
|
4(n=28) |
0,499± 0,0251 |
0,668± 0,0311 |
1,479± 0,121 |
|
5(n=33) |
0,458± 0,0241 |
0,689± 0,0171 |
1,684± 0,1161 |
|
6(n=28) |
0,498± 0,0221 |
0,667± 0,0171 |
1,434± 0,0871 |
|
Контроль (n=21) |
0,693± 0,031 |
0,426± 0,014 |
0,642± 0,038 |
Примечания: различия с контролем достоверны при 1 p< 0,001,
2 0,025, 5 0,005; *- текучесть глубоких слоев, ** - микровязкость поверхностных слоев, *** - коэффициент асимметрии текучести.
Отмечено, что у обследованных достоверно различаются показатели флуоресценции комплексов Са-ХТЦ в мембранах эритроцитов (начальная флуоресценция и пик флуоресценции), что подтверждает различное содержание в мембранах ионов кальция, ответственного за основные параметры клеточного реагирования. Скорость достижения пика флуоресценции комплексов Са-ХТЦ увеличивалась (табл.2) в исследуемых группах с 0,119±0,02 отн.ед./мин.(nd) в 1 группе до 0,206±0,02 отн.ед./мин (p<0,05) в 6 группе, что подтверждает увеличение проницаемости мембран для ионов кальция в период адаптационных перестроек. Нами выявлено (табл.2), что показатели пика флуоресценции мембранных комплексов Са-ХТЦ имеют максимальные значения во 2 - 16,97±1,88 отн.ед. (p<0,01) и в 4 группе - 16,45±1,26 отн.ед. (p<0,05). Это соответствует увеличению показателей начальной флуоресценции (табл.2) в этих группах (12,63±0,74 отн.ед. (p<0,001) в 1 и 11,26±1,21 отн.ед. (nd) - в 4 группе), что свидетельствует о повышении содержания ионов кальция в мембранах эритроцитов у данных индивидов. Таким образом, отмечено, что в период острой адаптации происходит накопление в мембранах эритроцитов ионов кальция (что согласуется с данными литературы) [5]. В дальнейшем кальциевый гомеостаз изменяется, наиболее вероятно, под воздействием вегетативных и гуморальных влияний в течение адаптационного процесса [1,5,6,7].
Таблица 2. Показатели флуоресценции комплексов Са-ХТЦ в мембранах эритроцитов у военнослужащих срочной службы в зависимости от продолжительности военной службы
|
Группа |
Показатели флуоресценции Са-ХТЦ |
||
|
НФ, отн.ед. |
ПФ, отн.ед. |
СДПФ, отн.ед./ мин |
|
|
1(n=27) |
11,37± 0,754 |
15,11± 1,17 |
0,119± 0,02 |
|
2(n=30) |
12,63± 0,741 |
16,97± 1,883 |
0,171± 0,03 |
|
3(n=28) |
9,78± 0,85 |
13,62± 1,074 |
0,164± 0,02 |
|
4(n=28) |
11,26± 1,21 |
16,45± 1,264 |
0,202± 0,03 |
|
5(n=33) |
8,33± 0,494 |
15,93± 1,61 |
0,251± 0,04 |
|
6(n=28) |
7,95± 0,693 |
13,66± 1,2 |
0,206± 0,024 |
|
Контроль (n=21) |
9,3± 0,42 |
13,53± 0,83 |
0,119± 0,01 |
Примечания: различия с контролем достоверны при 1 p<0,001,
30,01, 40,05; НФ - начальная флуоресценция, ПФ - пик флуоресценции, СДПФ - скорость достижения пика флуоресценции
Заключение. Выявлено, что в период острой адаптации у военнослужащих срочной службы наблюдаются максимальные изменения биофизических параметров мембран эритроцитов, что проявляется уменьшением коэффициента асимметрии текучести мембран и увеличением содержания мембраносвязанного кальция. Такие изменения, соответственно данным литературы [5,6], вызваны структурной модификацией мембран при остром адаптационном процессе. Увеличение содержания мембраносвязанного кальция в эритроцитах к концу первого года службы, вероятно, свидетельствует о включении других адаптационных регуляторных механизмов, в частности, вегетативных, оказывающих воздействие на метаболические процессы на уровне мембран.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
- Владимиров Ю.А. Роль нарушений свойств липидного слоя мембран в развитии патологического процесса//Патол. физиология и эксперим. терапия. 1989. №4. С.7-19.
- Заводник И.Б., Лапшина Е.А., Брышевска М. Эффект свободных жирных кислот на состояние липидного и белкового компонента мембран//Биол. мембраны. 1995. №5.С.516-523.
- Кешенов А.Н., Никусмячева Н.Г. Обмен липидов и липопротеидов и его нарушения. Руководство для врачей.- СПб: Питерком.- 1999.- 512 с.
- Махнев М.В., Махнев А.В. Медико-социальные аспекты адаптации военнослужащих//Военно-медицинский журнал. 2000.№9.С.57-64.
- Новицкий В.В., Рязанцева Н.В., Степовая Е.А. Физиология и патофизиология эритроцита. - Томск: Изд. ТГУ, 2004.- 202 с.
- Пшенникова М.Г. Феномен стресса: эмоциональный стресс и его роль в патологии//Патол. физиология и эксперим. терапия.№3.2000.С.20-26.