Недостатками способа являются: невысокая специфичность отобранных показателей [З.С.Баркаган, 1988; В.П.Балуда и др., 1995.], длительность определений (до 24 ч) и еще около 3-4 ч (математический анализ результатов) - всего около 28 ч, неоднозначность ответа (одни из перечисленных показателей могут уменьшаться, другие увеличиваться), качественный характер ответа: «толерантность уменьшилась или увеличилась».
Цель представляемой разработки - количественное определение толерантности экспериментальных животных к тромбину и ее изменений при разнообразных воздействиях.
Существенные признаки разработки таковы: 1) тромбин заданной активности вводится в яремную вену фиксированного животного после пробуждения от наркоза в количестве, определяемом массой тела животного (активность - 25 с по времени свертывания 0.2% раствора фибриногена, 1 мл/кг массы крысы); 2) отбор пробы крови производится через 30 мин в малом объеме (0.9 мл) в шприц с 0.1 мл 3.8% раствора трехзамещенного цитрата натрия; В плазме крови определяют единственный показатель - содержание фибриногена, свертываемого тромбином. По изменению содержания фибриногена после введения тромбина судят о толерантности к тромбину организма. Эффективность разработки по сравнению с ранее известными способами заключается в уменьшении числа определяемых показателей с 10 до 1-го, уменьшении числа используемых реагентов и препаратов, сокращении затрачиваемого на определение времени в 10-12 раз. Специфичность определений обусловлена тем, что фибриноген является основным субстратом тромбина в процессах свертывания [Д.М.Зубаиров, 2000; А.Ш.Бышевский и др., 1991.], тем, что изменения уровня реагирующего на тромбин фибриногена при экзогенной гипертромбинемии, положенной в основу способа, зависят от результативности работы всех систем, обеспечивающих выживание организма при ускоренном тромбинообразовании [З.С.Баркаган, 1988; В.П.Балуда и др., 1995].
Преимущества разработки заключаются в том, что её применение позволяет количественно оценивать степень изменения толерантности к тромбину при каком-либо воздействии по сравнению с контрольной группой животных.
Подтверждением эффективности разработки являются результаты описанного ниже эксперимента.
Партию животных, близких по массе тела, разделили на три одинаковые группы по 6 особей в каждой - группа 1-я контрольная, группа 2-я - животным в составе рациона вводили ацетилсалициловую кислоту в течение 3-х дней (4 мг/кг в день); группа 3-я - животным вводили L-тироксин как активатор тромбиногенеза в течение 3-х дней (35 мг/кг в день); группа 4-я - крысы воздействиям не подвергались - у них устанавливали содержание фибриногена в исходных условиях (в норме)
На 4-й день животным 1-й, 2-й и 3-й групп ввели в яремную вену слева раствор тромбина (1 мл/кг, активность 25 с) и через 30 мин взяли по 0.9 мл крови из яремной вены справа в шприц, содержавший).1 мл 3.8% раствора цитрата натрия, смешали, отделили плазму центрифугированием в течение 10 мин при 250 g. Одновременно взяли кровь у крыс 4-й группы. Определили содержание фибриногена во всех пробах, осадив его добавлением к плазме равного объема тромбина (0.1 мл и 0.1 мл) и экспозицией на водяной бане при 37оС в течение 10 мин. Сгусток фибриногена извлекли, промыли в 0.14 М растворе хлорида натрия, осушили фильтровальной бумагой, поместили в 1 мл 0.5 М раствора едкого натра и после инкубации на водяной бане при 60оС, охладив, определили оптическую плотность при 278 мкм. Содержание фибриногена установили по калибровочной кривой, построенной с растворами фибриногена разных концентраций.
Результаты:
- у крыс группы 4-й концентрация фибриногена - 2.2±0.04 г/л; у крыс, которым ввели тромбин без предварительного воздействия - 1.0±0.03 г/л; у крыс, получивших ацетилсалициловую кислоту - 1.4±0.02 г/л; у крыс, получавших тироксин, - 0.3±0.008 г/л.
Рассчитали остаточную концентрацию фибриногена по отношению к величине, найденной у интактных крыс по формуле:
D = 1- {[(Ск - Со) : Ск] х 100}
где D - остаточная концентрация фибриногена в %, Ск - концентрация у крыс группы 4-й (контроль - тромбин не вводили и воздействиям не подвергали), Со - концентрация фибриногена у получивших тромбин на фоне воздействия (в данном случае - введение ацетилсалициловой кислоты или тироксина).
Остаточная концентрация является характеристикой толерантности к тромбину - ее значения у крыс, которым тромбин ввели без предварительных воздействий, принимали за 100-процентную толерантность к тромбину. Это позволило рассчитать изменения толерантности в процентах:
Остаточная концентрация фибриногена в плазме крови (в % к исходной) у интактных крыс = 100-процентной толерантности; у животных сравниваемой группы толерантность равна Х%.
Согласно этой пропорции у крыс 2-й группы, которым вводили ацетилсалициловую кислоту, а затем тромбин (45.6 принято за 100%; 63.6 - за Х%) величина Х составила 139%.
Таким образом, величина толерантность к тромбину у крыс, получавших ацетилсалициловую кислоту, увеличилась до 139% и это согласуется с представлениями о способности ингибиторов превращения арахидоновой кислоты в тромбоцитах снижать угрозу тромбообразования [И.А.Дементьева, 1998].
У крыс 3-й группы (получали тироксин) - толерантность (Х%) снизилась до 29.8%, что согласуется с наблюдениями, выявившими низкую переносимость тромбина на фоне гипертиреоза [О.Ф.Мысник, 2000].
На такое же исследование, которое было выполнено примерно за три часа, упомянутые выше приёмы требуют более суток при использовании 12 реагентов вместо 3-х. Существенно и то, что результат, полученный с помощью предложенной разработки, выражен количественно и однозначно.