Научный журнал
Современные наукоемкие технологии
ISSN 1812-7320
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,007

Обеспечение стабильности процессов культивирования штаммов E.COLI – продуцентов рекомбинантных цитокинов

Гончарова О.В. Чугунова Н.М.
Одним из перспективных направлений, позволяющих быстро и эффективно получать рекомбинантные белки, является бактериальная гетерологическая экспрессия с использованием Escherichia coli. Существуют специальные генно-инженерные и физиологические приемы, позволяющие производить в клетках E. coli многие белки, имеющие фармацевтическое значение, в количестве, достаточном для их клинического применения.

В настоящее время особый интерес вызывает создание иммунобиологических препаратов с использованием  рекомбинантных белков, в частности, цитокинов.

В основе качества  медицинских иммуно-биологических препаратов, полученных с помощью ДНК-рекомбинантной технологии, лежит стабильность и воспроизводимость всех стадий технологического процесса. В отличие от обычных лекарственных средств, которые производятся с использованием химических и физических методов, обеспечивающих высокую степень стабильности, производство медицинских биологических препаратов имеет свою специфику, определяемую характером продукции и технологией производства, включающей процесс культивирования клеток. Биологические процессы характеризуются вариабельностью.  Длительное культивирование рекомбинантных штаммов довольно часто приводит  к возрастанию гетерогенности популяции за счет сегрегационной и структурной нестабильности плазмид, а также  изменения кинетических характеристик роста клеток. Такого рода популяционная неустойчивость сказывается не только на физиологических характеристиках роста продуцента, но и на уровне экспрессии рекомбинантного гена и конечном выходе целевого белка. Снижению генетической и физиологической  изменчивости рекомбинантных продуцентов способствуют различные приемы Для предотвращения нежелательного изменения свойств, которое может произойти вследствие многократных пересевов клеток, производство медицинских биологических препаратов должно быть основано, следуя рекомендациям FDA и  GMP, на системе основного и рабочего банков клеток. Подобная система хранения предусматривает использование клеток таким образом, что риск их загрязнения или изменения является минимальным.

Изменчивость культуры особенно отчетливо проявляется на стадии биосинтеза  целевого белка, поэтому при отработке условий культивирования продуцента необходимо найти оптимальное сочетание  параметров, обеспечивающих стабильность процесса в условиях метаболической перегрузки клеток и неустойчивости популяции в целом.

Уровень экспрессии рекомбинантного белка на стадии получения биомассы опреде-ляется не только составом питательной среды и условиями культивирования, но и качеством посевного материала продуцента. Выращивание посевного материала - одна из ключевых стадий, влияющая на стабильность дальнейших этапов биотехнологического  процесса. Продуктивность посевного материала зависит от многих факторов: генотипа рекомбинантного штамма, состава питательной среды, условий культивирования. Одним из основных критериев посевного материала является его физиологический возраст, который  определяет оптимальные сроки передачи инокулята на стадию ферментации. Наиболее качественным посевным материалом следует, очевидно, считать такой, который обеспечивает максимальное проявление генетически детерминированного уровня экспрессии целевого продукта. Никакой универсальной методики получения посевного материала не существует и для каждого продуцента оптимальную схему  приходится подбирать заново.

Методика, обеспечивающая получение стабильного посевного материала, наряду с соответствующими приемами консервации и хранения, способствует снижению изменчивости рекомбинантных продуцентов на стадии культивирования.

Целью настоящей работы было - создание банка клеток штаммов-продуцентов рекомбинантных цитокинов и отработка методик получения посевного материала, обеспечива-ющих стабильное воспроизведение основных характеристик роста продуцентов и уровня экспрессии рекомбинантных белков на стадии получения биомассы.

В работе использовали штаммы E. coli  - продуценты рекомбинантных цитокинов:

Г-КСФ, α2-интерферона  и β-интерферона.

Результаты: Изучено влияние различных условий хранения  и количества пассажей культур на стабильность штаммов - продуцентов рекомбинантных  цитокинов.  Оценена сегрегационная нестабильность плазмиды у всех изученных штаммов при различных условиях культивирования.  Полученные результаты позволили подобрать условия хранения и схемы культивирования продуцентов, позволяющие максимально снизить генетическую и физиологическую нестабильность рекомбинантных популяций.

Заложены на хранение основные и рабочие банки клеток рекомбинантных штаммов. При выборе условий хранения (состав среды, содержание криопротектора и температурный режим) руководствовались предварительными результатами проверки генетической и физиологической стабильности трансформиро-ванных клеток, хранящихся при различных условиях.

При закладке на хранение и периодически в процессе хранения проводилось  контрольное культивирование продуцентов и определялись характеристики роста,  уровень экспрессии рекомбинантного белка и рестрикционный анализ плазмиды. Показано, что на стабильность основных параметров штамма при длительном хранении влияют не только условия хранения, но и физиологическое состояние клеток, закладываемых на хранение.

Количество пассажей между банком клеток и ферментацией определялось для каждого продуцента индивидуально, после изучения его физиологических  особенностей  и закреплялось в нормативной документации.

Достоверно показано, что использование культур из банка клеток, обеспечивает стабильное воспроизведение основных параметров роста и экспрессии  рекомбинантных цитокинов в процессе культивирования продуцентов и не приводит к снижению их продуктивности.

Изучены основные этапы культивирования рекомбинантных штаммов. Определены признаки продуцентов, являющиеся существенными при оценке качества посевного материала. Разработаны методики приготовления посевного материала, исключающие пересевы на агаризованных средах, которые обычно снижают уровень рекомбинантной экспрессии. Определены условия выращивания посевного материала, которые позволили стабилизировать его качество по признаку соотношения резистентных и чувствительных к ампициллину клеток (amp R/S). Предложенные схемы культивирования обеспечивают 100% содержание amp R клеток в инокуляте, что способствует снижению гетерогенности популяции на стадии ферментации и обеспечивает стабильное воспроизведение  параметров роста штаммов-продуцентов, при сохранении структурной целостности плазмиды и уровня экспрессии рекомбинантных белков. Отработанные методики  были успешно апробированы в процессе масштабирования, и используются для наработки стандартного посевного материала для ферментаций в 75-литровом аппарате.


Библиографическая ссылка

Гончарова О.В., Чугунова Н.М. Обеспечение стабильности процессов культивирования штаммов E.COLI – продуцентов рекомбинантных цитокинов // Современные наукоемкие технологии. – 2006. – № 8. – С. 77-78;
URL: https://top-technologies.ru/ru/article/view?id=24808 (дата обращения: 01.02.2023).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.685