Были исследованы различные механизмы выживания и сохранения биологической активности при взаимодействии адронного облучения в пучке Серпуховского протонного ускорителя У-70 (коллайдера с энергией до 76 ГэВ) Государственного Научного Центра Института физики высоких энергий (ГНЦ ИФВЭ, г. Протвино) и биологических объектов (мишеней). Широкий спектр биологических объектов - от простых и модифицированных водных сред, микроорганизмов, субклеточных частиц и клеток до млекопитающих и семян растений - позволил нам моделировать основные механизмы саморегуляции, репарационных процессов, происходящих на субклеточном, клеточном и организменном уровне, и, в конечном счете, экстраполировать полученные данные на человека. Основу вторичного потока, генерирующегося на внутренней мишени ускорителя протонами, составляют ядерные частицы (нуклоны, мезоны, нейтроны, протоны, антипротоны) и их производные мезоатомы и мезомолекулы различного вида и заряда, способные к сильным взаимодействиям - адроны высоких энергий (АВЭ). АВЭ могут вызывать распад ядра любого атома. Особенностью их воздействий является крайне высокая неравномерность поглощенной энергии в зонах, охваченных и не охваченных пучками вторичных частиц. Сходный характер энергетических спектров адронов в поле вторичного излучения ускорителя и космического излучения позволяет моделировать биологические воздействия жесткого космического излучения на ускорителе. Физическую природу локального ионизирующего эффекта ядер и АВЭ в космическом пространстве нам удалось моделировать благодаря разработке приборов: полимерных детекторов порогового действия для регистрации тяжелых ядер первичного космического излучения и рентгеновских эмульсионных камер с фотоэмульсионными стопками для изучения воздействия АВЭ сверхвысокой энергии (> 1012 эВ) в стратосфере и на ускорителе. γ-облучение проводили в Институте биофизики клетки (ИБК) РАН на установках ГУБЭ изотопом 60Со и ГУПОС - изотопом 137Cs. Отмечена высокая степень множественных генераций вторичных частиц (ионизации) в тканях и клетках при действии АВЭ - выше, чем при γ-облучении. Биологические эффекты АВЭ и повреждения адронами микроструктур (мембран, субклеточных частиц), тканей и целых организмов носили значительный и множественный характер, но встречались с низкой частотой, и, в отличие от γ-облучения, в большинстве случаев не зависели от дозы, интенсивности и времени его воздействия. γ-излучение не оказывало макролокальных изменений.
Впервые нами было обнаружено специфическое действие АВЭ на биообъекты, выражающееся во множественном возникновении мутаций делеционного типа (от небольших до протяжённых) и во множественном повреждении хромосомных структур в одной клетке [1]. Изучение динамики выхода точечных и делеционных мутаций у белых беспородных мышей, растений Kolonchoe peristoe и семян томатов Licopersicon esculentum Mill, в клетках Е.соli и бактериофага Т4Вr+ при действии АВЭ в дозе от 1 Гр до 40 Гр позволило определить дозы максимального и минимального мутагенного действия АВЭ на биологические объекты. γ-излучение не вызывало макромутаций в клетках Т4Br+ и млекопитающих, спектр мутаций был иным. Ядерные (адронные) взаимодействия вызывают в биологических объектах более глубокие и менее способные к репарации генетические и морфологические повреждения, чем электромагнитный тип взаимодействия (γ-ионизация) [1, 2]. На основании цитогенетических тестов (множественные аберрантные клетки, крупные и протяженные делеции), летального действия АВЭ были рассчитаны более низкие величины (2-5) относительной биологической эффективности (ОБЭ) для метаболизирующих объектов (бактерий, растений) по сравнению с ОБЭ для неметаболизирующих бактериофагов Т4Br+ (4-8), не способных к репарации in vitro. Эффект γ-излучения выше на метаболизирующие и пролиферирующие клетки и ткани.
В облученной АВЭ и γ-радиацией клетке in vivo и in vitro обнаружены биологически активные вещества - водорастворимые радиотоксины (РТ), являющиеся продуктами радиационно нарушенного метаболизма клетки. Нами показан летальный и мутагенный эффект РТ при заражении γ-облученных бактерий Е. соli В интактным бактериофагом Т4Br+. Наибольший выход г-мутантов наблюдался при облучении бактерий на плотной агаровой среде дозой 4 крад (20 мутантов на 4⋅104 фагочастиц). Облученные бактерии находились в течение 2 ч при 37°С и затем заражались бактериофагом с последующим 2-часовым выдерживанием при +4°С для успешного мутагенеза в γ-облученной клетке бактерий интактной фаговой ДНК. Анализ (методом «спот-теста») 120 гII - мутантов, полученных под действием РТ, показал, что первичные молекулярные изменения оснований в ДНК фага представлены несколькими типами: транзицией - 80-85 %; трансверзией - 10-15 %; делецией, инверсией, транслокацией - 5-10 %. Данные изменения могут, по-видимому, вызываться перекисями, хинонами, необычными аналогами оснований, длительно живущими радикалами, являющимися РТ. Исходя из приведенных данных, можно сделать вывод о том, что интоксицируя организм, радиотоксины, состоящие из группы мутагенных метаболитов, обладают генетически полифункциональным действием. Изучение вклада РТ в общее лучевое поражение показало, что данная величина достигает ЛД50/30 для бактерий и фагов. При изучении летального и мутагенного действия ионизирующего излучения необходимо учитывать как прямой эффект радиации, так и опосредованный - через РТ [18]. Опосредованный эффект обладает большим биологическим действием и молекулярной специфичностью в отношении наследственной структуры.
Было изучено влияние АВЭ и γ-облучения на биологические объекты по выживаемости в течение 30 суток наблюдения после их облучения [1, 9]. Определены ЛД50, ФИД (фактор изменения дозы) и ОБЭ, зависимости выживаемости млекопитающих (белые беспородные мыши), бактерий Е.соli В и Е.соli К-12, бактериофага Т4Br+, растений (Kolonchoe peristoe) и прорастания семян томатов (Licopersicon esculentum Mill) от дозы АВЭ и γ-облучения. Величины ЛД50 были меньше для АВЭ: для мышей и крыс они составляли 0,47 и 0,55 Гр (для γ-облучения 0,6 и 0,65 Гр). Растения (конские бобы) оказались значительно более устойчивы к облучению: для АВЭ ЛД50 22 Гр, при γ-облучении 40 Гр. 100 % гибель бактерий наблюдалась при еще более высоких дозах: при облучении АВЭ - 800 Гр, при γ-облучении - 1400 Гр. Следовательно, космические излучения АВЭ по сравнению с γ-облучением оказывают более сильное летальное действие на биологические объекты. Обнаружен локальный радиационный фактор по выживаемости бактериофага в ампулах, случаи 100 %-ной гибели 1010 фагочастиц при воздействии излучения ускорителя в дозе 75 Гр до сих пор не получили физического и биофизического объяснения.
При радиолизе биологических структур под воздействием АВЭ и γ-излучения возможно возникновение веществ с ярко выраженными кислотными свойствами, приводящими к увеличению концентрации Н+-ионов [Н+] в среде. Исследовалось влияние [Н+] на γ-повреждение бактериофага Т4Br+ и бактериальных клеток Е. сoli В. Суспензии фага (титр 2,5⋅107) и бактериальных клеток (титр 109) в растворе 0,1 М NаС1 облучали γ-лучами 60Со в дозе от 0,5 до 10 кР в интервале рН 7,0-2,0. Различную кислотность среды создавали с помощью НС1, а также фосфатного (рН 7,0-5,0) и ацетатного (рН 6,0-4,0) буферов. Во всей области кислотной устойчивости рН 7,0 - 3,0 (при рН < 3,0 происходило резкое падение титра фага) обнаруживается экспоненциальная зависимость выживаемости фага от дозы γ-излучения. С увеличением [Н+] LD37 существенно уменьшается. Так, LD37 при изменении рН от 6,0 до 3,0 понижается на 90 %. Рассматриваются возможные механизмы явления протонной сенсибилизации (ЯПС) γ-радиационного поражения бактериофага и бактериальных клеток. При анализе механизмов и эффективности действия РТ на биологические системы необходимо учитывать ЯПС [17]. При малых дозах γ-облучения животных и растений зависимость выживаемости и других метаболических ответов «доза-эффект» носит, как правило, нелинейный колебательный характер. При летальных дозах немонотонность сглаживается за счет разрушения механизмов поддержания гомеостаза [14].
При γ-облучении животных помимо органоспецифических были установлены половые различия в радиочувствительности. Оказалось, что эстрогены (для обоих полов) существенно снижают резистентность (повышают радиочувствительность), а прогестерон - значительно повышает устойчивость к радиации (снижает радиочувствительность). Естественные половые различия радиочувствительности (реактивности) достигают значительной величины. Ведущую роль в их формировании играют, по-видимому, изменения в системе регуляции, поскольку внутривидовые изменения генома и рецепторов (нервных и гормональных) в норме возможны, как известно, лишь в ограниченных пределах. Кроме того, гормоны, модифицирующие радиочувствительность организма, действуют не только на специфические, но и на все другие ткани. Их влияние проявляется сначала на молекулярном уровне, а затем распространяется на все уровни организации организма. Известно, что местом приложения гормонов наряду с ядерным аппаратом информации являются мембраны и аппараты синтеза белка - рибосомы. По нашим и литературным данным, эстрогены и прогестерон изменяют функции мембран in vivo и in vitro (опыты с искусственными бислойными липидными мембранами). Под действием этих гормонов меняется активность сукцинатдегидрогеназы, лактатдегидрогеназы, глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы, Н+-АТФазы и других ферментов, а также их изоэнзимный состав [3]. Была определена связь между гормонами пола, активностью пролиферации и продолжительностью клеточных циклов. Один из вероятных механизмов действия гормонов, как регуляторов реактивности, это: гормон → мембраны → геном → рибосомы (уровень ошибок рибосомального кодирования) → ферменты → метаболический и энергетический обмен.
Показан стимулирующий эффект малых доз γ-облучения на метаболизм многих живых организмов. Высказано предположение, что ведущее значение в эффекте стимуляции имеет ионизация молекул, радиационное возбуждение в конденсированном биополимере, в результате чего электроны делокализуются, взаимодействуют с осцилляционной кинетической энергией биополимера, образуя длительно живущие вихревые сгустки энергии - поляритоны [24]. Поляритоны, медленно распадаясь, дают очень слабоинтенсивные вторичные когерентные излучения [25]. По нашим и литературным данным действие различных видов излучений (АВЭ, ЭМИ, γ-излучения, космических тяжелых заряженных частиц, полей коронного разряда, ультрафиолетового излучения) в малых дозах на семена-детекторы различных видов (кукуруза, подсолнух, фасоль, горох, кресс-салат, конские бобы и др.) вызывает образование поляритонов, свободных радикалов в низких нетоксичных концентрациях, которые находятся в лигнине оболочки семян, в белках и липидах мембран. При последующем добавлении воды к семенам и поступлении кислорода из воздуха начинаются окислительные реакции, образование перекисных радикалов, возникают цепные реакции окисления, которые способствуют окислению липидов, сульфгидрильных групп, полиенов, полифенолов, образованию хинонов, гидрохинонов и семихинонов. При активации прорастания семян под действием физических факторов происходит образование поляритонов, эффектора-триггера, деблокирование и дерепрессия генов, синтез и-РНК и ферментов, репарация ДНК [16], повышение уровня транспорта ионов в клеточных мембранах, метаболизма и клеточной энергетики. При высоких летальных дозах вышеуказанных излучений образуются свободные радикалы и активные формы кислорода, вызывающие сильный окислительный стресс, происходит лавинообразный запуск образования РТ, нарушение энергетики клеточных мембран, мутации и разрывы ДНК, блокирование синтеза de novo белка, гибель клеток и организма [5].
При длительном, хроническом воздействии различными малыми дозами в течение 10, 15 или 20 суток в поле излучения АВЭ за верхней бетонной защитой Серпуховского ускорителя и γ-излучения 60Со, полученного на установке ИБК РАН для изучения действия малых доз γ-излучения, на 16 видов семян, находящихся на разном расстоянии от источника излучения, было получено как стимулирующее, так и ингибирующее действие на скорость прорастания семян и роста проростков. Исследовался механизм действия этих излучений на модифицированные водные и водно-белковые растворы, на фармпрепараты, обладающие антиоксидантными и прооксидантными свойствами, а также на растения Kolonchoe peristoe. Механизм молекулярного действия излучений на растения коланхое и семена был сходным, но характер физиологического действия оказался более выраженным для АВЭ. Получены данные о механизмах сезонного адаптивного ответа изученных видов растений (2008-2010 гг.).
В настоящее время нет надежной радиозащиты (РЗ) от воздействий АВЭ, но она крайне необходима при работе на ускорителях и в космических полетах. Поиск эффективных средств защиты от адронных биоповреждений затруднителен в связи с тем, что биологические объекты обладают малоэффективными системами репарации к сильным воздействиям АВЭ. Нами был получен достаточно высокий антимутагенный эффект от АВЭ в дозе 0,2-10 Гр на ускорителе, при выращивании бактерий E.coli и бактериофага Т4Br+ в пептонном бульоне [1]. При действии летальных и сублетальных доз γ-облучения 5-8 Гр был показан высокий профилактический и терапевтический радиозащитный эффект (20-90 %) синтетических (из классов двухосновных кислот, замещенных салициланилидов) и природных (эхинохрома, убихинона, оротовой кислоты, биофлавоноидов, антоцианов, каротиноидов) липофильных мембранотропных веществ [5, 6, 8]. Основные первичные механизмы их действия на молекулярно-клеточном уровне проявляются в их антиоксидантной и слабой протонофорной активности, способности связывать свободные радикалы, изменять мембранный ионный транспорт и клеточную энергетику [7, 9]. Наиболее эффективные из этих соединений могут являться радиопротекторами от γ-облучения низкими и высокими дозами на АЭС, например, в условиях Чернобыля. При действии летальных доз γ-облучения на лабораторных мышей нами был получен радиозащитный эффект низкоинтенсивного ЭМИ радиочастотного диапазона [10, 23]. С помощью биофизического экспресс-метода были выявлены несколько потенциальных природных радиопротекторов из классов биофлавоноидов, каротиноидов, убихинонов и пептидов гибернирующих млекопитающих с антиоксидантным и другими механизмами действия для сохранения активности биологических объектов (млекопитающих, клеток Е.соli и бактериофага) при адронном воздействии. Для предварительного отбора радиопротекторов на разных уровнях организации живого организма были использованы: метод измерения электропроводности бислойных липидных мембран, полярографический метод, ЭПР, ЯМР, спектрофотометрический и калориметрический метод, метод хемилюминесценции. В качестве возможных радиопротекторов для защиты человека от АВЭ могут быть также испытаны вещества, которые влияют на передачу нервного импульса и внутриклеточную сигнализацию [9, 21, 22]. Отобранные соединения нами были рекомендованы для последующей проверки на лабораторных животных (мышах, крысах) при облучении различными дозами АВЭ. Определение ФИД и ОБЭ для препаратов при изучении кривых выживаемости млекопитающих в зависимости от дозы и мощности дозы АВЭ необходимы для определения эффективности РЗ исследованных соединений и выявления средней продолжительности жизни животных. Изучен молекулярный механизм РЗ при синергетическом действии высокоактивных соединений у γ-облученных животных в пострадиационный период [9]. Получена более высокая радиомодифицирующая эффективность исследованных нами комплексных антиоксидантных препаратов с мексидолом и фенотропилом по сравнению с их отдельными компонентами [11-13] при действии γ-облучения, ЭМИ и рентгеновского облучения высокой интенсивности на лабораторных животных. Можно ожидать синергизма радиозащитного эффекта действия природных соединений с различным механизмом действия от АВЭ. По мутабильности и выживаемости исследованы механизмы синергизма действия на биообъекты γ-радиации и токсических веществ, например, хиноидных РТ - модельного и образующегося при облучении из тирозина [15, 19].
Исследования действия АВЭ на биологические объекты необходимы при изучении их влияния на биосферу Земли, вопросов возникновения и эволюции жизни, онто- и филогенеза, возможности экспансии жизни на другие планеты. Изучение адронных эффектов в биофизике и биологии имеет важное теоретическое значение в связи с тем, что из четырех известных типов фундаментальных, физических взаимодействий (электромагнитных, сильных, слабых, гравитационных) материальных объектов в адронных взаимодействиях участвуют все кроме гравитационных [4].
Исследованы все четыре типа основных физических взаимодействий на примере реликтовых компонент космического излучения, являющихся переносчиками этих взаимодействий [4, 20]. Предложена «реликтовая концепция», согласно которой компенсация электронов в атоме за счет резонансно поглощаемого реликтового излучения (РИ) может приводить к возникновению вторичного биогенного поляризованного излучения, которое может быть использовано для стимуляции прорастания семян и роста клеток после воздействия АВЭ. РИ и природный радиационный фон поддерживают биоту Земли в неравновесном активном состоянии, способствующем росту и развитию живых организмов. Изучение сложного комплекса адронных взаимодействий, ЭМИ, γ-излучения и способов защиты от них имеет также важное практическое значение в связи с необходимостью защиты персонала ускорителя, АЭС и космонавтов в длительных космических полетах. Эти проблемы решались в группе специалистов, работавших в области космической биологии, радиобиологии и биофизики клетки. В 1969-1989 гг. проводились совместные научные исследования сотрудников ИБК РАН и ГНЦ ИФВЭ на Серпуховском ускорителе протонов в Протвино, начавшиеся вскоре после его запуска, а с 2008 г. также с ИТЭБ РАН и двумя московскими организациями.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
- Акоев И.Г. // Проблемы космической биологии. - Л.: Наука, 1989. - Т. 60. С. 60.
- Акоев И.Г., Юров С.С. К биофизике сильных взаимодействий адронов высоких энергий. Пущино, 1973. 32 с.
- Алексеева Л.В., Кожокару А.Ф., Солонина Е.Д. // Успехи космической биофизики. Пущино, 1978. С. 3.
- Дмитриевский И.М., Юров С.С., Кожокару А.Ф. // Современные проблемы науки и образования. - 2008. - № 5. - С. 7.
- Кожокару А.Ф., Заславский Ю.А., Акоев И.Г. // Радиобиология. - 1980. - Т. 20. - №6. - С. 902.
- Кожокару А.Ф., Заславский Ю.А., Акоев И.Г. // Радиобиология. - 1981. - Т. 22. - №4. - С. 545.
- Кожокару А.Ф. // Информац. бюлл. радиобиологии. - 1983. - №22. - С. 68.
- Кожокару А.Ф. и др. // Радиобиология. - 1986. - Т. 26. - №1. - С. 35.
- Кожокару А.Ф. Направленная модификация структурно-функционального состояния мембран с целью повышения устойчивости клеток и организма к факторам окружающей среды. Дисс. д. ф-м.н. - М.: МНО «Форум». 1992. - 88 с.
- Кожокару А.Ф., Мельников В.М., Акоев И.Г. // Радиационная биология и Радиоэкология. - 1994. - Т. 34. - №5. - С. 671.
- Кожокару А.Ф. // XVI Росс. Конгр. «Человек и лекарство». - М., 2009. - С. 540.
- Кожокару А.Ф., Юров С.С., Нечитайло Г.С. // Там же. - С. 539.
- Кожокару А.Ф. // XVII Росс. Конгр. «Человек и лекарство». - М. 2010. - С. 642.
- Коломейцева И.К. // Биофизика. - 2009. - Т. 54. - 5. С. 946.
- Копылов В.А., Ревин А.Ф., Кузин А.М. // Всес. конф. «Проблемы синергизма в радиобиологии». - Пущино, 1990. - С. 48.
- Кузин А.М. Структурно-метаболическая теория в радиобиологии. - М.: Наука, 1986. - 284 с.
- Шабарчина Л.И., Юров С.С., Сухоруков Б.И. // Успехи космической биофизики. - Пущино, 1978. - С. 53.
- Юров С.С. // Успехи космической биофизики. - Пущино, 1978. - С. 54.
- Юров С.С., Щелкаева Н.В. // Проблема синергизма в радиобиологии. - Пущино, 1990. - С. 53.
- Юров С.С., Кожокару А.Ф., Дмитриевский И.М. // Современные проблемы науки и образования. - 2008. № 5. С. 24.
- Cojocaru A.F., Fomkina M.G., Khashaev Z.Kh.-M. // Int. Conf. «Regulation of free radical reactions». Bulgaria, Varna. - 1989. - P. 29.
- Cojocaru A.F. // XI Int. Congress of neuropathology. Japan, Kyoto. 1990. P. 17.
- Сojocaru A.F., Melnikov V.V., Akoev I.G. // Biophisics. 2005. V. 50. s. 1. P. S116.
- Dicke R.N. Quantum electronics. Ed. Blaembergen N., Grivet P. Dunod, 1974.
- Popp F.A. Electromagnetic bio-information. Eds. Popp F.A. et al. Munchen, 1989. - P. 144.