Разработка легкоосуществимых и экономически целесообразных способов разделения аминокислот относится к приоритетным биотехнологическим и аналитическим задачам. Решение задачи возможно методом жидкостной экстракции с применением смеси гидрофильных растворителей. Сведения о количественных характеристиках экстракции физиологически активных соединений необходимы для обоснования условий их извлечения, концентрирования, разделения и селективного определения, в частности, при непрерывной ферментации аминокислот, пептидов, белков [8].
Для разработки способа разделения тирозина и глицина изучена экстракция этих аминокислот из водных растворов тройной смесью гидрофильных растворителей (бутиловый спирт - этилацетат - ацетон). Гидрофильные растворители и их смеси имеют известные преимущества по сравнению с гидрофобными растворителями: повышенная растворяющая способность по отношению к аминокислотам, возможность разделения тирозина и лизина в зависимости от соотношения компонентов в смеси и определения аминокислот в экстракте электрофоретическим методом. Капиллярный электрофорез отличается высокой точностью определений, экспрессностью, малым расходом реактивов [1,3].
Обязательным условием применения гидрофильных растворителей в качестве экстрагентов является насыщение водной фазы электролитом, снижающим растворимость распределяемых соединений в воде в результате гидратации. Изучено высаливание тирозина и глицина в системах с сульфатами, хлоридами, нитратами лития, калия, натрия. Установлено, что сульфат лития - наиболее эффективный высаливатель изучаемых аминокислот, практически нерастворим в применяемых экстрагентах.
Тирозин и глицин экстрагировали из насыщенных водно-солевых растворов по известной методике [6]. Концентрат анализировали с применением системы капиллярного электрофореза «Капель-105» снабженного источником высокого напряжения положительной полярности. Содержание тирозина и глицина в концентратеопределяли с помощью встроенного фотометрического детектора при длине волны 254 нм. Запись и обработку полученных данных осуществляли с применением программного обеспечения «МультиХром». Анализ проводили при напряжении +23 кВ и температуре 30 ± 1°С. Для разделения тирозина и глицина в капилляре в качестве добавки к фоновому электролиту применяли боратный буферный раствор (рН = 9,18). При таком рН аминокислоты существуют в виде анионов и таутомеров с биполярной ионизированной структурой, поэтому возможно получение электрофореграммы тирозина и глицина с четким разрешением (рис.1).
Коэффициенты распределения (D) и степень извлечения (R,%) тирозина и глицина вычисляли по известным формулам [4].
Основанием для разделения тирозина и глицина служат различия в коэффициентах распределения в системе насыщенный водно-солевой раствор аминокислот - тройная смесь гидрофильных растворителей [2]. Установлено, что коэффициенты распределения аминокислот зависят от соотношения компонентов в смеси растворителей. Для применения тройных смесей растворителей в качестве экстрагентов необходимо оптимизировать соотношение отдельных компонентов в таких смесях. Решение задачи связано с получением большого массива экспериментальных данных. Ранее нами оптимизирован состав тройной смеси гидрофильных растворителей методом симплекс-решетчатого планирования эксперимента и разработаны системы, в которых достигаются максимальные коэффициенты распределения аминокислот [4,5]. На основании этих данных моделировали такой состав смеси гидрофильных растворителей, при котором достигается 97%-ное и более полное извлечение глицина, а тирозин в основном полностью остается в водном растворе.
Рис.1. Электрофореграмма тирозина и глицина
Одним из факторов, влияющим на разделение аминокислот, является рН водного раствора. Тирозин и глицин экстрагировали из подкисленных водно-солевых растворов (рН ~ 5). В таких условиях тирозин находится в растворе в виде биполярного иона, глицин - практически полностью в экстрагируемом (неионизированном) состоянии. Механизм экстракции глицина, содержащего протонодонорные и протоноакцепторные функциональные группы, определяется как их природой, так и взаимным расположением заместителей. Глицин экстрагируется смесью гидрофильных растворителей из водно-солевых растворов за счет образования межмолекулярных водородных связей, причем сольватация амино- и карбоксигрупп может происходить с протонным переносом и в его отсутствии [7]. Добавление к активному растворителю (ацетон) апротонного растворителя (этилацетат) усиливает сольватацию глицина бутиловым спиртом, способствует повышению коэффициентов распределения и достижению практически полного (~ 97%-ного) извлечения глицина.
Максимальнй фактор разделения достигается при концентрации тирозина 0,008 мг/см3, глицина 0,012 мг/см3 и соотношении компонентов в смеси бутиловый спирт - этилацетат - ацетон, равном 6:1:3. При однократной экстракции в оптимизированных условиях степень извлечения тирозина не более 15 %, глицина - 97 %.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:
- Ванифатова Н.Г., Спиваков Б.Я. Разделение наночастиц методом капиллярного зонного электрофореза // Рос. хим. журн. 2005. Т. 25, № 2. С. 16 - 21.
- Коренман Я.И. Коэффициенты распределения органических соединений. Справочник. Воронеж: Изд-во Воронеж. гос. ун-та, 1992. 336 с.
- Манаенков О.В., Сидоров А.И., Сульман Э.М. Экспресс-определение аминокислот методом капиллярного электрофореза без их предварительной дериватизации // Журн. аналит. хим. 2003. Т. 58, № 10. С. 1093 - 1096.
- Мокшина Н.Я., Нифталиев С.И., Пахомова О.А. Экстракция тирозина и фенилаланина смесью гидрофильных растворителей из водно-солевого раствора. // Изв. вузов. Химия и хим. технология. 2005. Т.48, № 1. С. 109 - 112.
- Мокшина Н.Я. Нифталиев С.И., Пахомова О.А. Экстракция некоторых алифатических аминокислот из водных растворов с применением смеси гидрофильных растворителей // Хим. технология. 2005. № 5. С. 44 - 46.
- Мокшина Н.Я., Пахомова О.А., Нифталиев С.И. Экстракция аспарагина гидрофильными растворителями из водных растворов// Изв. вузов. Химия и хим. технология. 2006. Т.49, № 4. С. 8 - 11.
- Селеменев В.Ф., Мокшина Н.Я., Котова Д.Л. Физико-химические особенности взаимодействия компонентов при экстракции аминокислот бутиловым спиртом // Изв. вузов. Химия и хим. технология. 1999.Т. 42. № 2. С. 32-35.
- Селеменев В.Ф., Хохлов В.Ю., Бобрешова О.В., Аристов И.В., Котова Д.Л. Физико-химические основы сорбционных и мембранных методов выделения и разделения аминокислот. Воронеж: Изд-во Воронеж. гос. ун-та. 2001. 300 с.
- Якубке Х.-Д., Ешкайт Х. Аминокислоты. Пептиды. Белки. М.: Мир. 1985. 456 с.