Scientific journal
Modern high technologies
ISSN 1812-7320
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,021

Введение. В настоящее время в семейство белков - продуктов альбуминоидных генов входят: сывороточный альбумин (CА), альфа-фетопротеин (АФП), альфа-альбумин (афамин) и витамин Д-связывающий белок (ВДСБ). Представители этого семейства обладают примерно одинаковой молекулярной массой (от 66 до 82 кДа), при этом различия в их молекулярной массе обусловлены, преимущественно, разным содержанием углеводов. Эти белки демонстрируют относительно высокую степень сходства первичной структуры (например, до 40% идентичности наблюдается между аминокислотными последовательностями СА и АФП) с характерным расположением остатков цистеина [1, 2]. Они имеют также сходную пространственную организацию, представленную тремя гомологичными доменами (I-III), сшитыми равномерно расположенными межспиральными дисульфидными связями [3].

Альбуминоидные гены расположены последовательно друг за другом в 5-ой хромосоме у мыши и в субцентромерной области q11-22 4-ой хромосомы у человека и их нуклеотидные последовательности обладают высокой степенью сходства [4, 5]. Предполагается, что все гены данного семейства произошли от некоего предкового гена, кодировавшего полипептидную цепь, соответствующую одному домену и состоящую примерно из 190 аминокислотных остатков (а.о.) [6, 7]. Путем удлинения (трипликации) предкового гена образовался ген-предшественник, кодирующий трехдоменную полипептидную цепь. Затем произошла серия дупликаций гена-предшественника с образованием четырех независимых генов.

Minghetti и соавт., а затем Gibbs и соавт. [8, 9] определили количество синонимичных и несинонимичных нуклеотидных замен в альбуминоидных генах и выяснили, что белки этого семейства характеризуются разной скоростью эволюции. Наибольшая скорость эволюции была определена для афамина, который накапливает 27.1% замен а.о. за 100 миллионов лет (Myr). Скорость эволюции АФП (22.5% замен а.о. за 100 Myr) выше, чем альбумина (20.2% замен а.о. за 100 Myr) и наименьшая для ВДСВ (18% замен а.о. за 100 Myr). На основании этих расчетов было подсчитано приблизительное время дивергенции этих белков: около 580 Myr назад - ВДСВ, 295 Myr назад - альбумин и 250 Myr назад - АФП и афамин.

Материалы и методы. Нами было осуществлено сравнительное изучение первичных структур методом попарного выравнивания незрелых (полных) и зрелых (после процессинга) аминокислотных последовательностей белков семейства альбуминоидных генов у разных биологических видов и оценена степень сходства между белками по степени идентичности, а также общее сходство с учетом консервативных замен а.о. в каждой паре белков. В современных базах данных первичных структур белков (Swiss-Prot и TrEMBL) нами были обнаружены аминокислотные последовательности всех четырех представителей этого семейства лишь для трех биологических видов - человека, мыши и крысы. Ещё для пяти биологических видов расшифрованы первичные структуры двух белков семейства: свиньи, лошади, собаки и курицы - альбумина и АФП, кролика - альбумина и ВДСБ (табл.1).

Выравнивание аминокислотных последовательностей осуществляли использованием программы ClustalW (версия 1.82). Для выравнивания использовались следующие параметры:

- Матрица - Gonnet,

- Штраф за факт пробела (Gap Open) - 10.0

- Штраф за протяженность пробела (Gap Extension) - 0.2

- ENDGAP = -1

- GAPDIST = 4

Таблица 1. Аминокислотные последовательности, использованные для выравнивания

Название белка

Длина

аминокислотной

Последовательности (а.о.)

Код доступа

в базу данных

АФП человека

609

P02771

АФП мыши

605

P02772

АФП крысы

611

P02773

АФП курицы

615

P84407

АФП свиньи

610

Q8MJ76

АФП лошади

609

P49066

АФП собаки

609

Q8MJU5

Альбумин человека

609

P02768

Альбумин мыши

608

P07724

Альбумин крысы

608

P02770

Альбумин свиньи

607

P08835

Альбумин лошади

607

P35747

Альбумин собаки

608

P49822

Альбумин курицы

615

P19121

Афамин человека

599

P43652

Афамин мыши

611

O89020

Афамин крысы

608

P36953

ВДСБ человека

474

P02774

ВДСБ мыши

476

P21614

ВДСБ крысы

476

P04276

Сходство а.о. в каждой паре аминокислотных последовательностей определяли по формуле:

- степень идентичности = ni/ n x 100%,

- общее сходство = (ni+nc)/n x 100%, где ni - количество идентичных а.о.,

- n - длина выравниваемых последовательностей с учетом пробелов (гэпов), nc - количество консервативных замен.

Результаты и обсуждение. Полученные результаты показывают, что степень идентичности между парами полных (незрелых) последовательностей АФП и альбумина уменьшалась в ряду от курицы (40.3%) к человеку (40.0%), собаке (38.7%), свинье (37.3%), лощади (34.9%), мыши (34.4%) и крысе (32.3%). Общее сходство между последовательностями уменьшалось также от курицы (64.2%) к человеку (63.9%), собаке (63.6%), лошади (61.8%), свинье (61.5%), мыши (61.3%) и крысе (58.4%). Выравнивание зрелых аминокислотных последовательностей дало аналогичные результаты (за исключением собаки и свиньи, для которых выравнивания зрелых последовательностей не производилось в связи с отсутствием информации о длине сигнального пептида для их СА).

Для других пар белков было осуществлено выравнивание у трех биологических видов - человека, мыши и крысы. Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2. Значения сходства аминокислотных последовательностей для разных пар белков у трех биологических видов

Пары белков

Значения идентичности для разных видов животных (в %). В скобках показано значение общего сходства (в %).

человек

мышь

крыса

альбумин-АФП

 

40.0

(63.9)

34.4

(61.3)

32.3

(58.4)

АФП-афамин

 

38.7

(65.4)

31.8

(58.1)

31.7

(57.3)

альбумин-афамин

 

33.8

(60.3)

29.6

(54.7)

28.2

(56.7)

альбумин-ВДСБ

 

21.4

(47.2)

21.2

(47.3)

20.8

(43.9)

АФП-ВДСБ

 

15.7

(36.3)

19.1

(41.7)

18.7

(41.5)

афамин-ВДСБ

 

18.5

(45.4)

16.8

(40.3)

17.1

(41.8)

Видно, что наибольшее сходство у всех биологических видов характерно для пары альбумин-АФП и далее сходство убывает в парах АФП-афамин, альбумин-афамин, альбумин-ВДСБ. Однако в парах АФП-ВДСБ и афамин-ВДСБ наблюдается неравномерность убывания сходства у человека и у грызунов.

Если в парах АФП-афамин и альбумин-афамин сходство четко уменьшается в ряду человек, мышь, крыса, то в паре альбумин-ВДСБ значения идентичности мало отличаются у разных биологических видов. Примечательно то обстоятельство, что сходство аминокислотных последовательностей в паре АФП-ВДСБ заметно выше у мыши и крысы, чем у человека. Возможно, здесь имеет место неравномерность дивергенции белков у разных биологических видов.

Согласно концепции молекулярных часов [10, 11] каждый белок обладает характерной и постоянной скоростью эволюции. Механизм, приводящий часы в движение, определяется мутациями, происходящими в генах, кодирующих тот или иной белок и накапливаемых с момента дивергенции генов. Различия в последовательностях ДНК или белка у разных видов могут быть использованы для определения времени их дивергенции от общего предка.

Ранее было показано, что скорость эволюции одного и того же белка может значительно различаться у разных биологических видов [9]. Также было замечено, что скорость эволюции АФП выше у грызунов, чем у других млекопитающих. Наши результаты показывают неравномерность убывания сходства в парах АФП-ВДСБ и афамин-ВДСБ у человека и у грызунов. В паре АФП-ВДСБ сходство заметно выше у мыши и крысы, чем у человека, в то время как в остальных белковых парах сходство аминокислотных последовательностей выше у человека.

Возможно, такие различия определяются скоростью накопления мутаций в аминокислотных последовательностях у разных биологических видов, отличающихся разной скоростью генерации потомства и разными размерами популяций. Чем меньше скорость генерации и чем меньше размер популяции, тем быстрее происходит фиксация мутаций в популяции.

Ход молекулярных часов может определяться также функциями белков. Быстро эволюционирующие белки, видимо, могут претерпевать значительные структурные изменения без существенного влияния на их функции. Большая часть мутаций в этих белках оказываются индифферентными к естественному отбору. Часть мутаций в медленно эволюционирующих белках, приводящая к нарушению их функционирования, элиминируются в процессе естественного отбора, и не фиксируется в популяции. Следовательно, быстро эволюционирующие белки должны сохранять функционально важные участки и специфичность функций, в то время как медленно эволюционирующие белки утрачивают их.

Известно, что сывороточный альбумин не обладает какими-либо специфическими функциями. Он способен неспецифически связывать различные гидрофобные лиганды и ионы металлов, а также играет важную роль в поддержании коллоидно - осмотического давления плазмы крови. ВДСБ является также мультифункциональным белком, который в сыворотке крови транспортирует витамин Д, а также связывает мономеры актина, предотвращая их полимеризацию. Биологическая роль альфа-фетопротеина до конца не выяснена. Однако показано, что АФП обладает рядом специфических функций и в его составе выявлены функционально важные участки, ответственные за те или иные его функции. Активность части из этих участков подтверждена в различных экспериментальных моделях, других - лишь предсказана путем сравнения аминокислотных последовательностей АФП и некоторых факторов роста, белковых гормонов и ряда других белков. Показано, что АФП способен с высокой специфичностью связывать эстрогены и жирные кислоты, выявлены и экспериментально подтверждены участки, ответственные за эти функции.

Таблица 3. Cходство эстрогенсвязывающих участков альфа-фетопротеина и афамина

Названия белков

Аминокислотные

последовательности

Степень

идентичности

Доля

консервативных

замен

Суммарное сходство

АФП /афамин крысы (а.о.424-438/425-439

ELIDLTGKMVSIAST*

 

ELVSLSKEMVAALAT

 

6/15

(40%)

5/15

(33%)

73%

АФП /афамин

человека (а.о. 428-452/425-439

ELMAITRKMAATAAT**

 

ELVSLGEKMVTAFTT

5/15

(33%)

6/15

(40%)

73%

АФП /афамин

человека (а.о. 458-472/453-467

AADI IIGHLCIRHEM*

 

LADLVFGELCGVNEN

6/15

(40%)

4/15

(27%)

67%

АФП/ афамин мыши(424-438/425-439

ELIDLTGKMVSIAST**

 

ELVSLSKEMVAALTT

6/15

(40%)

5/15

(33%)

73%

Нумерация а.о. дана для зрелых (после процессинга) последовательностей белков.

* означает функциональный участок с экспериментально подтвержденной активностью,

** означает функциональный участок с предполагаемой активностью

Функции афамина остаются пока еще мало изученными, в связи с тем, что этот белок обнаружен относительно недавно. Однако есть данные, говорящие в пользу того, что афамин человека способен специфически связывать и транспортировать витамин Е и совместно с витамином Е или самостоятельно предотвращать апоптоз нервных клеток [12]. Данные о том, что афамин является наиболее быстро эволюционирующим белком данного семейства [9], позволяют предположить, что он должен характеризоваться сохранностью консервативных а.о. в функционально важных участках.

Мы провели сравнительный анализ аминокислотных последовательностей афамина и АФП, для которого экспериментально установлены специфические функционально важные участки. В составе афамина человека, мыши и крысы обнаружены участки, обладающие высокой степенью сходства с эстрогенсвязывающими участками АФП (табл.3).

Эти данные, наряду с тем, что в составе сывороточного альбумина подобные участки не обнаружены, могут указывать на то, что афамин, возможно, способен связывать и транспортировать эстрогены.

Заключение. Полученные нами результаты демонстрируют неравномерность убывания сходства в парах белков АФП-ВДСБ и афамин-ВДСБ у человека и у грызунов по сравнению с другими парами белков, производных альбуминоидных генов, которую мы не можем объяснить в рамках гипотезы «молекулярных часов». Эти данные могут свидетельствовать о неравномерности дивергенции белков семейства альбуминоидных генов у млекопитающих. Попарное сравнение методом выравнивания первичных структур белков с известной функцией с белками, функции которых неизвестны, позволяет с большей степенью вероятности предсказывать возможные функционально-активные участки в первичных структурах изучаемых белков.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

  1. Morinaga T., Sakai M., Wegmann T.G., Namaoki T. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 4604-4608.
  2. Ruoslahti E., Terry W.D. (1976) Nature, 260, 804-805.
  3. He X.-M., Carter D. (1992) Nature, 358, 209-21.
  4. Harper M.E, Dugaiczyk A. (1983) Amer. J. Hum. Gen., 35, 565-572.
  5. Ingram R.S., Scott R.W., Tilghman. S. M. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 4694-4698.
  6. Gorin M.B., Cooper D.L., Eiferman F., Van de Rijn P., Tilghman S.M. (1981) J. Biol. Chem. 256, 1954-1959.
  7. Brown J.R. (1976) Fed. Proc. 35, 2141-2144.
  8. Minghetti P.P., Law S. W., Dugaiczyk. A. (1985) Mol. Biol. Evol. 2(4), 347-358.
  9. Gibbs P. E.M., Witke W. F., Dugaiczyk A. J. (1998) Mol. Evol. 46, 552-561.
  10. Zuсkerkandl E., Pauling L. (1965) In V. Bryson and H. J. Vogel, eds. Evоlving genes and proteins, 97-166. Academic Press, New York.
  11. Dickerson R. E. (1971) J. Mol. Evol. 1, 26-45.
  12. Неiser M., Hutter-Paier B., Jercovic L., Pfranger R., Windisch M., Becker- Angre M., Dieplinger H. J. (2002) Neural Transm. Suppl. 62, 337-345.