Для выделения комплекса ферментов из цельной мышечной ткани карпа животный материал измельчали и тщательно растирали с кварцевым песком в среде следующего состава: 50 мМ трис-НСl буфер (рН - для карпа составлял 7,5-7,8), 3 мМ MgCl2; 1 мМ ЭДТА; 3 мМ β - меркаптоэтанол. Полученный экстракт фильтровали через 4-х слойный марлевый фильтр и центрифугировали при 3000g 10 минут. Для определения активности изучаемого комплекса ферментов и дальнейшей его очистки использовали полученный супернатант.
Для приготовление промывных вод фарша карпа использовали тушки карпа, хранившиеся при -25 °С в течении 20 суток. Рыбу размораживали на воздухе при температуре 18-20 °С до температуры 0-2 °С, промывали в пресной воде и белую мышечную ткань измельчали на мясорубке с dотв. = 2,5 мм
(ОСТ 15-19-76). Полученный фарш дважды промывали на двойном капроновом фильтре питьевой водой с рН 6,8-7,0 при перемешивании в течение 10 мин. Все операции проводили при температуре 0-4 °С. Катепсины мышечной ткани экстрагировали 0,05 %-м КСl.
Для освобождения осадка от клеток мышечной ткани, неразрушенные ткани, полученные после отжимания гомогената, промывали в среде выделения в течение 2 мин. Оставшиеся ткани проводящих пучков тщательно растирали с кварцевым песком в фарфоровой ступке на холоде в среде выделения того же состава в соотношении 1:3, затем центрифугировали при 5000g в течение 10 мин. Полученный супернатант использовали в дальнейшем для очистки и изучения свойств катепсинов из клеток мышечной ткани карпа.
Очистку проводили при 0-4 ºС в несколько стадий.
Далее определяли фракционный состав ферментного комплекса, выделенного из мышечной ткани карпа, были проведены электрофоретические исследования, которые проводили в условиях кафедры технологии мяса и мясных продуктов Воронежской государственной технологической академии на приборе вертикального электрофореза VE-1M (ООО «Биоклон»), предназначенном для электрофоретического разделения белков в полиакриламидных и агарозных гелях.
Исследуемый образец ферментного комплекса вносили в карман геля по 5 мкл. В качестве лидирующего красителя использовали Sample buffer (×2) (0,125 M Трис-HCl, 4% ДСН, 20% v/v глицерин, 10% 2-меркаптоэтанол, 0.004% бромофеноловый синий, рН 6,8). В первые 10 мин сила тока составляла 15 мА/гель, затем, после вхождения образца в гель, - 25 мА/гель. После окончания электрофореза выявление белковых полос проводили окрашиванием геля в течение 40 мин в растворе Comassie brilliant blue G-250 (содержащий 2% ТХУ, 20 % этанола). Краситель отмывали 6% ТХУ с многократной сменой раствора. Отмытые гели погружали в раствор, содержащий этиловый спирт и воду в соотношении 1:1.
По результатам электрофореграммы в ферментном комплексе было выделено пять фракций, молекулярная масса которых находилась в пределах от 35 до 95 кДа, причем вторая фракция количественно преобладает по сравнению с остальными и лежит в пределах 45-66,2 кДа, что весьма близко к щелочным и нейтральным протеиназам, среди которых наиболее известны металлопротеиназы.
Наличие дополнительных полос в спектре комплекса, можно объяснить несколькими причинами. Во-первых, фермент часто представляет собой гетерогенную систему, сочетающую в своем составе несколько компонентов, обладающих различным спектром активности. Во-вторых, в процессе хранения ферментного комплекса могут образовываться различные минорные компоненты, дополняющие спектр препарата. Физико-химические свойства позволяют конкретизировать электрофоретические исследования.
Результаты проведенных исследований, показали, что выделенный ферментный комплекс обладает комплексным составом, включая ферментные системы катализирующие расщепление белков, углеводов и липидов, что открывает широкие перспективы его применения в пищевой промышленности.
Библиографическая ссылка
Кравцова Ю.С., Антипова Л.В., Дворянинова О.П., Алехина А.В. ПОЛУЧЕНИЕ И ИССЛЕДОВАНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ФЕРМЕНТНОГО КОМПЛЕКСА МЯСА ПРУДОВЫХ РЫБ // Современные наукоемкие технологии. – 2010. – № 3. – С. 44-45;URL: https://top-technologies.ru/ru/article/view?id=24584 (дата обращения: 19.04.2024).