Scientific journal
Modern high technologies
ISSN 1812-7320
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,021

Многоэтапная система контроля поддержания постоянства энтеральной среды дает сбои при критических состояниях, патологических процессах в желудочно-кишечном тракте, различного рода токсемиях, сопровождающихся нарушениями процессов секреции и всасывания. Возрастает нагрузка на другие органы детоксикации и метаболической коррекции: печень, легкие, почки, кожу. В свою очередь, нарушение функции этих органов и накопление в крови недоокисленных продуктов метаболизма ведет к повышению их выделения в просвет желудочно-кишечного тракта. Посредством такого взаимодействия органов и систем на фоне относительной функциональной специализации возможны перераспределение метаболической нагрузки и усиление роли желудочно-кишечного тракта в детоксикации, выведении продуктов обмена, включение кишки в дополнительные звенья регуляции гомеостаза. Эту способность можно усилить путем введения энтеросорбентов, связывающих агрессивные компоненты химуса. С начала серийного выпуска модифицированных сорбентов энтеросорбция привлекла внимание клиницистов простотой выполнения. В основе метода лежит возможность обратного извлечения токсических веществ из крови в кишку и дальнейшее их связывание на сорбентах.

Большой интерес представляют водорастворимые и водонерастворимые препараты хитозана, дающие вязкие растворы и гели. Хитозан имеет уникальную линейную поликатионную фибриллярную структуру и обеспечивает адгезионное сродство к компонентам клеточных мембран. Хитозан имеет два типа реакционноспособных групп, создающих возможность проведения более разнообразной их модификации, осуществление строго направленного синтеза производных по OH- и NH2-группам. Дополнительно протонированная аминогруппа (NН3+) является высокоактивной. Хитозан является полисахаридом органического происхождения. Высокая биосовместимость, нетоксичность, даже в больших дозах, биодеградабельность, низкое раздражающее действие на слизистую оболочку кишки полимера хитозана и его химических производных открывают широкие возможности их использования при лечении синдрома эндогенной интоксикации. Необходимо отметить высокую адсорбционную активность хитозана при переходе его из растворимого в коллоидное состояние в двенадцатиперстной кишке, где среда постепенно изменяется от кислой до нейтральной и слабощелочной. Чем ниже молекулярная масса хитозана, тем меньше размер его полимерной молекулы, тем легче ему обнаружить точки взаимодействия с глобулой фермента, необходимые для образования межмолекулярного комплекса. При этом степень связывания аминогрупп с ферментом увеличивается и пропорционально возрастает активность биокатализатора. По мере увеличения молекулярной массы хитозана степень связывания фермента с полисахаридом уменьшается вследствие возникновения стерических препятствий при подходе более объемных молекул полимера к биокатализатору.

Известно, что мукоадгезивный эффект хитозана формирует эффект перфузии через эпителиальный слой клеток. Если контакт хитозана с эпителиальными клетками происходит непосредственно без прослойки компонента слизи, то эффект абсорбции веществ, включая и плохо растворимые субстанции, становится высоким. Слой слизи выполняет барьерную функцию. Степень замещения ацетильных групп на аминные и величина молекулярной массы полимера играют существенную роль в активности направленного транспорта веществ. Установлено с помощью 14С-маннитола и 14С-полиэтиленгликоля усиленное проникновение через монослой клеток кишечного эпителия этих веществ в сторону хитозана. Градиент проницаемости в сторону гидрохлорида хитозана возрастает в 34 раза, глутамата хитозана - в 25 раз, N-триметилхитозан хлорида - в 11 раз. При повышении концентрации полимера проницаемость веществ увеличивается. Выявлено, что процесс проницаемости заключается в открытии плотных межклеточных контактов слизистой оболочки, что существенно усиливает околоклеточный транспорт. Важными факторами является заряд и плотность полимера, структура хитозана и его производные. Эти физико-химические свойства определяют эффективность абсорбции. При повышении степени положительного заряда в полимере усиливается проницаемость гидрофильных макромолекул, таких как полипептиды и белки. Повышение степени дезацетилирования хитина до 40-60% приводят к росту транспорта мембранопроникающей флюоресцентной метки. Усиление транспорта сопровождается переносом веществ, состоящих с пептидами в комплексе. Кроме того, усиление абсорбции гидрофильных веществ через эпителиальный слой кишки зависит от pH среды. При pH<7,0 в присутствии гидрохлорида или глутамата хитозана активная трансэпителиальная абсорбция веществ происходит в верхних отделах тонкой кишки. При увеличении ионной силы среды (pH>7,0) интенсивность абсорбции смещается в нижний отдел тонкой кишки и толстую кишку. Увеличение степени дезацетилирования (СД) хитозана до 0,85-0,99 еще больше усиливает околоклеточный транспорт и эффект абсорбции веществ. В этих условиях высокая абсорбция сочетается с низкой токсичностью. Во всех случаях увеличение концентрации полимера в тонкой кишке приводит к повышению проницаемости эпителия. При этом обратный транспорт пептидов через эпителиальный покров слизистой оболочки кишки в сторону заряженного хитозана будет сопровождаться перераспределением и связыванием токсического материала. Кроме того, рост биодоступности пептидов в комплексе с хитозаном, например, активированных ферментов может проявляться по отношению к своим субстратам, а это будет приводить к падению уровня их активности, что весьма важно при состоянии функционального дуоденостаза, сопровождающего деструктивный панкреатит.

При тяжелых формах панкреатита и сеансах энтеросорбции события детоксикации первично происходят в двенадцатиперстной кишке. При этом ключевое значение имеет установление роли и места хитозана в патогенезе острого панкреатита и механизмов детоксикации. Использование хитозана в качестве сорбента обусловлено широкими возможностями модификации структуры полимера, получения его в виде растворов, гелей и других лекарственных форм, способных свободно мигрировать через различные энтеральные дренажи.

Цель исследования состояла в разработке в эксперименте и апробировании в клинической практике способа детоксикации при деструктивных формах панкреатита с помощью гелевой формы хитозана и его химических производных. В задачи исследования входили: принципиальное установление эффективности энтеросорбции продуктами хитозана в детоксикации при экспериментальном жировом панкреонекрозе, разработка режимов энтеросорбции гелевыми формами хитозана, демонстрация динамики морфофункциональных изменений поджелудочной железы в условиях энтеросорбции хитозаном, апробирование результатов экспериментальных разработок в клинической практике при лечении пациентов с деструктивной формой панкреатита.

В работе использована экспериментальная модель жирового панкреонекроза на 108 крысах популяции Wistar (А.С. № 1259328, 1984), на которой отрабатывались режимы энтеросорбции (введение хитозановых гелей в двенадцатиперстную кишку различных концентраций (1%,2%,5% и 7%), рН (4,6,7 и 8), молекулярной массы (10кD, 100кD и 200кD), степени дезацетилирования (0,90-0,95), объема введения (по 0,5 мл/3 раза в день, по 2 мл/3 раза в день, по 2 мл/6 раз в день), длительности введения полимера (3 ,10,15 и 21 суток от момента моделирования заболевания), химического производного коллоидного хитозана (аскорбат, ацетат, глутамат), а также кинетика сорбции панкреатических ферментов (липаза, амилаза, трипсин) из тонкокишечного химуса больных животных с высоким уровнем этих ферментов. Перечисленные режимы сорбции устанавливались в период первых трех суток развития деструктивной картины панкреатита с привлечением контрольных групп животных (интактные, нелеченные, группы, получавшие контрольную матрицу сорбента - сефадекс G-25). Контроль сорбции осуществлялся путем регистрации клинической картины заболевания, выживаемости животных, уровней в плазме крови фракций билирубина, мочевины, креатинина, общего белка, альбумина, расшифровки протеинограммы, активности щелочной фосфатазы, АлАТ и АсАТ, ферментов амилазы, липазы, трипсина (биохимический анализатор Hitachi 912, Japan; автоанализатор Centrifichem 400, USA; автоанализатор FP 90 LM Lab.System, Finland). Микроскопический анализ ткани поджелудочной железы осуществлялся по гистологическим срезам, окрашенным гематоксилином и эозином и по Ван-Гизону.

В клинике произведена апробация метода энтеросорбции с использованием хитозановых гелевых сорбентов, в частности коллоидной формы хитозана с ММ 100 кD, СД 0,94 и рН 7,0 на базе реанимационного отделения, хирургических отделений ГКБ №7 г. Красноярска и содержит результаты применения предложенного метода у 5-ти больных с тотальным смешанным панкреонекрозом. Контрольную группу составили 10 больных со смешанной формой деструктивного панкреатита, у которых в послеоперационном периоде не использовалась энтеросорбция гелевыми формами хитозана.

Среди обследованных больных были лица обоего пола в возрасте от 35 до 65 лет, из них одна женщина и четыре мужчины. Сроки поступления в стационар колебались от 24 до 48 часов с момента начала заболевания. Этиологическим фактором начала заболевания в 3-х случаях было злоупотребление алкоголем, а в 2-х - желчнокаменная болезнь.

Диагноз острого деструктивного панкреатита был подтвержден клинико-лабораторными данными, результатами экстренного ультразвукового, а при наличии показаний, лапароскопического методов исследований и оперативного вмешательства.

Операции выполнялись в сроки от 24 до 48 часов с момента поступления больных в стационар. Объем операции состоял из верхне-срединной лапаротомии, абдоминизации поджелудочной железы, марсупиализации, дренирования сальниковой сумки и свободной брюшной полости.

На 3-4 сутки после операции и снятия ороинтестинальной интубации проводили в течение 5-ти суток сорбцию хитозановым гелевым сорбентом из расчета 4 мл/кг массы тела в комплексе с общепринятой схемой лечения.

Для контроля за эффективностью проводимого комплексного лечения использовались те же методики, что и в экспериментальном фрагменте работы.

С целью исследования влияния хитозанового лаважа на состояние дуоденостаза при панкреонекрозе (приоритет по заявке на изобретение от 21.04.03 за № 2003111584/14) гель хитозана (2%) со степенью дезацетилирования 0,75 и молекулярной массой 180-200 кD был использован у 12 пациентов. Клинический диагноз - тотальный смешанный панкреонекроз. Разлитой ферментативный перитонит - 8 больных, тотальный геморрагический панкреонекроз - 2 больных, очаговый жировой панкреонекроз - 2 больных. Продукт вводился и при отечной форме панкреатита - 24 больных. Хитозан вводился по кишечному зонду по 20 мл через 6 - 8 часов 2 - 3 раза в сутки в течение 3-5 суток в послеоперационном периоде. У больных с отечной формой панкреатита без оперативного вмешательства введение полимера - по желудочному зонду. Наряду с введением хитозана больные получали традиционную терапию (антибиотики, ингибиторы ферментов, средства, улучшающие реологические свойства крови, гипербарическая оксигенация, детоксикационные препараты - препараты для гемодилюции).

Результаты экспериментальных исследований установили, что наиболее эффективными гелевыми формами хитозана являются коллоидная форма, хитозан - аскорбат и хитозан - ацетат с ММ 10 кD, а также коллоидная форма хитозана, хитозан - глутамат и хитозан - ацетат с ММ 100 -120 кD. Эффективность заключалась в коррекции нарушенных уровней ингредиентов крови из 14 контролируемых в следующем порядке: коллоидный хитозан - 4 ингредиента, хитозан аскорбат - 7, хитозан глутамат - 8, хитозан ацетат - 10. При этом последние 2 формы хитозана способны восстанавливать уровни амилазы, щелочной фосфатазы, АлАТ, общего белка и числа клеток белой крови с большой степенью вероятности (р<0,01). При использовании любого производного хитозана с ММ 100-120 кD из 14 ингредиентов крови коррекция затрагивает 5-8, что указывает на эффективность детоксикации (патент РФ № 2196587).

Все исследованные разновидности гелевых хитозановых сорбентов оказывали положительное терапевтическое действие, которое проявлялось в поведенческом статусе животных и существенном снижении летальности.

Исследование поведенческого статуса животных при энтеросорбции разными гелевыми формами солей хитозана показало, что уже в первые сутки отмечено благоприятное течение острого панкреатита. Большая часть животных активнее передвигалась по клетке, охотнее принимала пищу и воду, у них был меньше выражен цианоз. По сравнению с контрольной группой, в которой к 3 - 4 суткам летальность составила 100 %, у животных, получающих 2 % солевые производные органических кислот гелевых форм хитозана с ММ 100-120 кD и ММ 180-200 кD, летальность в эти сроки составила 5 %.

При энтеросорбции 2 % солевыми производными органических кислот гелевых форм хитозана с ММ 10 кD животные уже через сутки после операции активно передвигались по клетке, принимали пищу и воду, отсутствовал цианоз носа, ушных раковин, лапок. Животные в течение 3-х суток были активны, с хорошим аппетитом и выживаемость составила 100 %.

При энтеросорбции контрольным сорбентом сефадексом- 25 летальность в течение 3 суток составила 80 %. При вскрытии брюшной полости у всех погибших животных отмечены жировые некрозы в междольковой жировой ткани, располагающиеся в головке или хвосте, реже диффузно во всех отделах. Отмечалось большое количество бляшек жирового некроза на париетальной брюшине, поверхности желудка, петель тонкой и толстой кишки и сальников, выпот светло- желтого цвета в брюшную и плевральную полости до 2 мл.

 Каждый из перечисленных выше разновидностей хитозанов с ММ 10 кD заслуживает внимания своей способностью влиять на состав крови. Коллоидная форма хитозана с ММ 10 кD снижает уровень ферментемии на 38%, хитозан аскорбат, хитозан ацетат и хитозан глутамат - на 66%, 26% и 14%, соответственно. При энтеросорбции гелевыми сорбентами с ММ 100-120 кD наиболее перспективной формой для снижения симптомов эндогенной интоксикации является аскорбат хитозана, который достаточно эффективно позволяет купировать печеночную недостаточность, корригируя за короткий срок около 89% ингредиентов крови (АсАТ восстанавливается на 38%, АлАТ - на 48%). Другие виды сорбентов этой молекулярной массы оказываются на 22% менее эффективными.

Таким образом, полученные результаты биохимических и клеточных изменений в крови позволяют утверждать, что пероральное введение гелевых форм хитозановых сорбентов является неинвазивным эффективным эфферентным способом детоксикации при экспериментальном жировом панкреонекрозе. Снижение уровня амилаземии по сравнению с нелеченным жировым панкреонекрозом указывает на приостановление аутолиза в поджелудочной железе. Снижение уровня активности аминотрансфераз сыворотки крови говорит о приостановлении цитолитического процесса в гепато-билиарной системе и эффективности проводимых мероприятий. Суточный объем введения до 24 мл/кг массы обеспечивает коррекцию 70% нарушенных ингредиентов плазмы крови, из которых величина лейкоцитоза, фракции общего билирубина и мочевины восстанавливаются с высокой степенью вероятности (30%) (р<0,01). Свидетельством этого служит 100% показатель выживаемости животных, быстрое снижение маркеров эндогенной интоксикации крови и признаки сохранения ацинарной ткани поджелудочной железы. Соли органических кислот, модифицирующих хитозан, улучшают сорбционные характеристики полимера. Увеличение эффективности детоксикации солей органических кислот хитозана объясняется тем, что в условиях рН<7,0 начинают дополнительно протонироваться за счет избытка ионов водорода (Н+) аминогруппы полимера (NH2 → NH3+), что увеличивает суммарный заряд поликатиона. Такая модификация хитозана усиливает электростатические взаимодействия не только с поверхностью слизистых оболочек желудочно-кишечного тракта, но и с отдельными молекулами и их комплексами (билирубином, креатинином, мочевиной). В результате обеспечивается не только дренирование из крови (перфузия и перераспределение) этих ингредиентов, но и химическое связывание их в кишечном химусе.

Проведенный в динамике анализ биохимических ингредиентов крови крыс при экспериментальном жировом панкреонекрозе при условии постоянного кормления на 10, 15 и 21 сутки показал эффективное восстановление нарушенных функций при энтеросорбции продуктами хитозана, в частности гелевой формы "Амидан". Чем длительнее совершаются сеансы энтеросорбции, тем больше ингредиентов крови приходит к норме. К 10 суткам эксперимента уровень активности амилазы снизился на 43%, к 21суткам - на 68%; щелочной фосфатазы, соответственно, на 33,7% и осталось стабильным в течение 3-х недель наблюдения (35,7%). Полное восстановление АлАТ регистрируется к 15 суткам, АсАТ - к 21 суткам эксперимента. Общий белок восстанавливается в самые ранние сроки. Этот факт можно объяснить длительностью перфузии интерстициального пространства, при которой с течением времени происходит большее связывание патологических субстратов на хитозановом полимере в полости желудочно-кишечного тракта. При этом уменьшается поступление продуктов распада в кровь, снижается проникновение токсинов в брюшную полость и образование ферментативного перитонеального экссудата, который является одним из ведущих факторов прогрессирующего эндотоксикоза. При интестинальном лаваже хитозан одновременно воздействуют на два основных звена патогенеза эндогенной интоксикации - панкреатогенную токсемию и ферментативный перитонит.

Кроме того, энтеролаваж хитозаном предупреждает развитие бактериальных осложнений, поскольку свойства полимера - это флокуляция и нарушение мембранных функций всех видов микрофлоры, связывание экзотоксинов грамотрицательных микробов.

Активное извлечение в стендовом эксперименте из дуоденального содержимого в условиях in vitro таких ферментов как амилаза, трипсин, липаза означает, что происходит инактивация протеолитических и липолитических ферментов с помощью хитозана посредством комплексообразования белков и аминогрупп. Результатом такого взаимодействия становится активное удаление из химуса кишки активных белков.

Оценивая эффективность энтеросорбции больных с диагнозом тотальный смешанный панкреонекроз, разлитой ферментативный перитонит, можно констатировать, что через одни сутки после введения в ДПК сорбента отмечается тенденция к снижению уровня маркеров эндогенной интоксикации. Достоверное снижение относится только к количеству лейкоцитов (на 7,9 %).

Если через 1 сутки при общепринятой методике лечения панкреонекроза активность амилазы остается высокой и неизменной, то применение хитозана приводит к 10% ее снижению. Из 8 регистрируемых ингредиентов крови в контрольной группе больных через 5 суток энтеролаважа достоверной коррекции подвергаются 5 показателей (62,5%), из которых динамика амилазы по сравнению с долечебным периодом составляет 54,6%, АсАТ - 40%, общей фракции билирубина - 10,8%, числа лейкоцитов - 54,5%. В исследуемой группе пациентов хитозановый энтеролаваж через 5 суток лечения обеспечил коррекцию 7 исследуемых показателей крови (87,5%). Коэффициент коррекции по сравнению с долечебным периодом по амилазе составил 56,4%, по АсАТ - 40%, по билирубину - 71,8%, по мочевине - 41,7%, по числу лейкоцитов - 65,4%. Кроме того, для хитозановой сорбции характерно полное восстановление общей фракции белка и альбумина. Таким образом, интегральная эффективность энтеросорбции на фоне интенсивной терапии деструктивной формы панкреатита составила 25 %.